Desarrollo de líneas celulares tumorales humanas por ingeniería genética a partir de cultivos primarios de tejidos de antro y cavidad bucal

RESUMEN: Introducción: El cáncer escamocelular de cabeza cuello (CECC) y el cáncer gástrico (CG) son los tumores de peor pronóstico por la heterogeneidad genética y la falta de modelos experimentales adecuados para realizar estudios funcionales. Las células humanas transformadas por ingeniería genét...

Full description

Autores:: Bautista Amorocho, Henry

Tipo de recurso:: Doctoral thesis

Fecha de publicación:: 2023

Institución:: Universidad de Antioquia

Repositorio:: Repositorio UdeA

Idioma:: spa

Description
Summary:	RESUMEN: Introducción: El cáncer escamocelular de cabeza cuello (CECC) y el cáncer gástrico (CG) son los tumores de peor pronóstico por la heterogeneidad genética y la falta de modelos experimentales adecuados para realizar estudios funcionales. Las células humanas transformadas por ingeniería genética proporcionan una estrategia para evaluar la función de genes supresores de tumor (GST) y protooncogenes durante la carcinogénesis. Materiales y métodos: Se estandarizó un método mecánico-enzimático para aislar células epiteliales de mucosa de antro y tejido gingival de porcino y humano. Las condiciones del cultivo se optimizaron con factores de crecimiento y suplementos para mantener en genotipo y fenotipo epitelial hasta por 45 días. Vectores lentivirales que portaban oncogenes como transgén se diseñaron por mutagénesis dirigida en protooncogenes C-MYC, KRAS y CTNNB1; también, se diseñaron sondas de ARNA guía con el sistema CRISPR-Cas9 para inactivar GST TP53, APC, CDH-1MLH-1 y PTEN. Los cultivos primarios se modificaron secuencialmente con el coctel de sondas sintéticas de ARN guía CRISPR y la enzima Cas9 en liposomas para inactivar los GST en monocapas de células gástricas y gingivales. En un segundo ensayo, los lentivirus se adicionaron para sobre expresar los oncogenes e inducir tumorigénesis. El fenotipo y genotipo de las células primarias, células transformadas y la carcinogénesis se evaluaron con diferentes ensayos. Resultados: Un protocolo mecánico y enzimático se optimizó para aislar gastrocitos y células gingivales utilizando combinaciones de colagenasa I y dispasa II en presencia de inhibidor de la tripsina de soja y ditiotreitol para reducir el daño a la membrana plasmática y preservar la viabilidad celular durante la digestión del tejido. El medio William’s suplementado con factor de crecimiento epidermal, insulina, insulina-transferrina-selenio y suero bovino permitió conservar las características epitelial de los cultivos hasta por 45 días. Los gastrocitos no incorporaron las modificaciones genéticas con CRISPR Cas9 y lentivirus y la monocapa se desprendió totalmente 45-50 días pos aislamiento. Por el contrario, las células gingivales formaron monocapas policlonales inmortales y a partir de estas se aislaron tres monoclones transformados (CEGM1, CEGM2 y CEGM3) que se cultivaron hasta por 6 meses para luego conservarlos en nitrógeno líquido. La caracterización genotípica confirmó la expresión de genes de mucinas y sobre expresión de oncogenes; además, el fenotipo epitelial se demostró por la presencia de varias citoqueratinas ácidas y básicas por inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Finalmente, el ensayo de crecimiento independiente de anclaje, curva de crecimiento y cariotipo por bandeo G, confirmaron el fenotipo tumoral en los tres monoclones. Conclusiones: Dos protocolos diferentes se estandarizaron para aislar y cultivar gastrocitos y células gingivales epiteliales a partir de explantes, utilizando un método mecánico-enzimático. Se desarrolló el primer modelo de células tumorales de CECC por ingeniería genética en cultivos primarios humanos a partir de tejidos gingivales sanos. Se recomienda identificar los indels en GST inducidos con CRISPR, secuenciar el genoma y epigenoma y evaluar las carcinogénesis de las células gingivales inmortales en modelos murinos.

Desarrollo de líneas celulares tumorales humanas por ingeniería genética a partir de cultivos primarios de tejidos de antro y cavidad bucal

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