Producción del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano recombinante en Komagataella pastoris (Pichia pastoris)

La producción de proteínas recombinantes en levaduras se ha vuelto cada vez más frecuente debido a los beneficios que representan, tales como su fácil manipulación, la capacidad para generar modificaciones postraduccionales y la alta viabilidad para el escalado del proceso. Dentro de las proteínas p...

Full description

Autores:
López Carvajal, María Camila
Moreno Pino, Juan José
Tipo de recurso:
Trabajo de grado de pregrado
Fecha de publicación:
2024
Institución:
Universidad ICESI
Repositorio:
Repositorio ICESI
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repository.icesi.edu.co:10906/130354
Acceso en línea:
https://hdl.handle.net/10906/130354
https://biblioteca2.icesi.edu.co/cgi-olib/?oid=365026
Palabra clave:
RhEGF
Proteínas recombinantes
ADN recombinante
K. pastoris
Trabajos de grado de Química Farmacéutica
RhEGF
Recombinant proteins
Recombinant DNA
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Rights
openAccess
License
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description La producción de proteínas recombinantes en levaduras se ha vuelto cada vez más frecuente debido a los beneficios que representan, tales como su fácil manipulación, la capacidad para generar modificaciones postraduccionales y la alta viabilidad para el escalado del proceso. Dentro de las proteínas producidas en dicho microorganismo se encuentra n algunas con potencial terapéutico, y otras con aplicaciones cosmétic as . Una de estas es el factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF ) , el cual es un polipéptido que se encuentra de forma natural en orina, plaquetas leche y plasma, se conoce que es fundamental en las vías de señalización celular que r egulan la división y la supervivencia celular . Además , se ha demostrado una buena capacidad en la reparación tisular , por lo que , es empleado en estudios para la regeneración de la piel en diversos campos que van desde curación de heridas hasta el tratamiento contra arrugas . E s importante destacar que hoy en día su producción no es lo suficientemente eficiente para la demanda que se tiene y que se espera . A partir de lo anterior , se ha planteado este proyecto , en búsqueda de desarrollar e implementar una metodología para la producción de este factor de manera recombinante mediante el uso de la levadura Komagatella pastoris , generando así conocimiento para diferentes sectores de la economía como lo son el educativo y el industrial.
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Una de estas es el factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF ) , el cual es un polipéptido que se encuentra de forma natural en orina, plaquetas leche y plasma, se conoce que es fundamental en las vías de señalización celular que r egulan la división y la supervivencia celular . Además , se ha demostrado una buena capacidad en la reparación tisular , por lo que , es empleado en estudios para la regeneración de la piel en diversos campos que van desde curación de heridas hasta el tratamiento contra arrugas . E s importante destacar que hoy en día su producción no es lo suficientemente eficiente para la demanda que se tiene y que se espera . A partir de lo anterior , se ha planteado este proyecto , en búsqueda de desarrollar e implementar una metodología para la producción de este factor de manera recombinante mediante el uso de la levadura Komagatella pastoris , generando así conocimiento para diferentes sectores de la economía como lo son el educativo y el industrial.The production of recombinant proteins in yeasts has become increasingly frequent due to the benefits they represent, such as easy manipulation, the ability to generate post-translational modifications, and high viability for process scaling. Among the proteins produced in this microorganism are some with therapeutic potential, and others with cosmetic applications. One of these is the human epidermal growth factor (hEGF), which is a polypeptide found naturally in urine, platelets, milk, and plasma. It is known to be fundamental in the cellular signaling pathways that regulate cell division and survival. Furthermore, it has demonstrated good capacity in tissue repair, which is why it is used in studies for skin regeneration in various fields ranging from wound healing to wrinkle treatment. It is important to note that today its production is not efficient enough for the current and expected demand. Based on the above, this project has been proposed, seeking to develop and implement a methodology for the recombinant production of this factor using the yeast Komagatella pastoris, thus generating knowledge for different economic sectors such as education and industry.1. Resumen . . . . . 5 -- 2. Introducción . . . . 5 -- 3. Metodología . . . . 7 -- 3.1. Establecimiento de las condiciones de crecimiento de Komagataella pastoris. . 7 -- 3.2. Establecimiento de las condiciones de crecimiento de Komagataella pastoris. . 8 -- 3.3. Determinación de las condiciones para la expresión del rhEGF . . 9 -- 3.3.1. Determinación del tiempo de inducción . . . 9 -- 3.3.2. Determinación de la concentración de metanol . . 9 -- 3.4. Verificación de expresión mediante SDS - PAGE y Western Blot . 10 -- 3.4.1. Tinción con plata . . . . 11 -- 3.5. Cuantificación de proteína por método de Bradford . . 11 -- 3.6. Concentración de la proteína rhEGF . . . 12 -- 4. Resultados y discusión . . . . 12 -- 4.1. Analisis por PCR del transgén de hEGF. . . . 12 -- 4.2. Determinación de las condiciones de expresión . . 13 -- 4.3. Verificación de la expresión de la proteína modificando la concentración del inductor . . . . . 17 -- 5. Conclusiones . . . . 22 -- 6. Agradecimientos . . . . 22 -- 7. Referencias . . . . 22Trabajo de Grado para obtener el título del Programa de Química FarmacéuticaProfesional24 páginasDigitalapplication/pdfspaUniversidad IcesiBarberi de Ingeniería, Diseño y Ciencias AplicadasQuímica FarmacéuticaSantiago de caliEL AUTOR, expresa que la obra objeto de la presente autorización es original y la elaboró sin quebrantar ni suplantar los derechos de autor de terceros, y de tal forma, la obra es de su exclusiva autoría y tiene la titularidad sobre éste. PARÁGRAFO: en caso de queja o acción por parte de un tercero referente a los derechos de autor sobre el artículo, folleto o libro en cuestión, EL AUTOR, asumirá la responsabilidad total, y saldrá en defensa de los derechos aquí autorizados; para todos los efectos, la Universidad Icesi actúa como un tercero de buena fe. Esta autorización, permite a la Universidad Icesi, de forma indefinida, para que en los términos establecidos en la Ley 23 de 1982, la Ley 44 de 1993, leyes y jurisprudencia vigente al respecto, haga publicación de este con fines educativos Todo persona que consulte ya sea la biblioteca o en medio electróico podrá copiar apartes del texto citando siempre la fuentes, es decir el título del trabajo y el autohttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internationalhttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Producción del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano recombinante en Komagataella pastoris (Pichia pastoris)bachelor thesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fTrabajo de gradoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85info:eu-repo/semantics/bachelorThesisTodo PúblicoRhEGFProteínas recombinantesADN recombinanteK. pastorisTrabajos de grado de Química FarmacéuticaRhEGFRecombinant proteinsRecombinant DNAK. pastoris1. Esquirol Caussa , J. & Herrero Vila, E. Un enfoque para el tratamiento de las úlceras de origen vascular: revisión y papel del factor de crecimiento epidérmico. Angiologia 68, 322 – 330 (2016).2. Zeng, F. & Harris, R. C. Epidermal growth factor, from gene organization to bedside. Semin Cell Dev Biol 0, 2 (2014).3. Esquirol Caussa, J. & Herrero Vila, E. Epidermal growth factor, innovation and safety. Medicina Clínica (English Edition) 145, 305 – 312 (2015).4. Verified Market Reports. Global Epidermal Growth Factor EGF Market By Type (Liquid EGF, Powder EGF), By Application (EGF Cream, EGF Lotion), By Geographic Scope And Forecast. https://www.verifiedmarketreports.com/product/epidermal - growth - factor - egf - market/ (2024).5. Stefonek - Puccinelli, T. J. & Masters, K. S. Co - immobilization of gradient - patterned growth factors for directed cell migration. Ann Biomed Eng 36, 2121 – 2133 (2008).6. Tamama, K., Kawasaki, H. & Wells, A. 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Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast vol. 22 249 – 270 Preprint at https://doi.org/10.1002/yea.1208 (2005).17. Eissazadeh, S. et al. Production of recombinant human epidermal growth factor in Pichia pastoris. Brazilian Journal of Microbiology 48, 286 – 293 (2017).18. Terpe , K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 60, 523 – 533 (2003).19. Ogiso, H. et al. Crystal Structure of the Complex of Human Epidermal Growth Factor and Receptor Extracellular Domains. Cell 110, 775 – 787 (2002).20. Lu, H. - S. et al. Crystal Structure of Human Epidermal Growth Factor and Its Dimerization . J. Biol. Chem. 276, 34913 – 34917 (2001).21. Yang, M. et al. Role of N - linked glycosylation in the secretion and enzymatic properties of Rhizopus chinensis lipase expressed in Pichia pastoris. Microb Cell Fact 14, 1 – 14 (2015).22. Santoso, A., Herawati, N. & Rubiana, Y. 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