Producción, estabilización y evaluación de la enzima retrotranscriptasa recombinante obtenida a partir de Escherichia coli BL21(DE3)
Molecular tests represent a key tool in the diagnosis of various diseases, particularly those of infectious origin. During the pandemic, these tests became the cornerstone of diagnosis due to their versatility, speed, specificity, and sensitivity, as they allowed for the implementation of timely tre...
- Autores:
-
Coy Gómez, Gabriela
Pérez Giraldo, Estefanía
- Tipo de recurso:
- Trabajo de grado de pregrado
- Fecha de publicación:
- 2024
- Institución:
- Universidad ICESI
- Repositorio:
- Repositorio ICESI
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- Acceso en línea:
- https://hdl.handle.net/10906/130373
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- Palabra clave:
- Retrotranscriptasa
Pruebas moleculares
Enzima
Diagnostico
RT - PCR
Enzima MMLV - RT
Trabajos de grado de Química Farmacéutica
Reverse transcriptase
Molecular tests
Enzyme
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Molecular tests represent a key tool in the diagnosis of various diseases, particularly those of infectious origin. During the pandemic, these tests became the cornerstone of diagnosis due to their versatility, speed, specificity, and sensitivity, as they allowed for the implementation of timely treatments and epidemiological containment measures. The RT - qPCR technique enabled the detection of the SARS - CoV - 2 virus; however, the overwhelming demand for these tests generated a shortage of critical supplies, particularly the MMVL - RT enzyme, essential for performing the technique. Therefore, in response to this scarcity and with the aim of ensuring a local supply of reverse transcriptase, Icesi University has proposed a comprehensive methodology for its obtention and storage. This methodology covers the production, stabilization, and evaluation of recombinant RT enzyme obtained in - house from Escherichia coli BL21(DE3). The work sequence includes the expression of the MMLV - RT enzyme in E. coli BL21(DE3) bacteria, followed by its purification through affinity chromatography using a histidine tag. Furthermore, the formulation of the enzyme in a storage buffer and the qualitative evaluation of enzymatic activity allowed for a comprehensive assessment of the quality attributes of the enzyme stored for one month. The result obtained was an enzyme with a high degree of purity, specific and functional, retaining its activity even after one month of storage at temperatures of 4ºC and - 20ºC. |
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The RT - qPCR technique enabled the detection of the SARS - CoV - 2 virus; however, the overwhelming demand for these tests generated a shortage of critical supplies, particularly the MMVL - RT enzyme, essential for performing the technique. Therefore, in response to this scarcity and with the aim of ensuring a local supply of reverse transcriptase, Icesi University has proposed a comprehensive methodology for its obtention and storage. This methodology covers the production, stabilization, and evaluation of recombinant RT enzyme obtained in - house from Escherichia coli BL21(DE3). The work sequence includes the expression of the MMLV - RT enzyme in E. coli BL21(DE3) bacteria, followed by its purification through affinity chromatography using a histidine tag. Furthermore, the formulation of the enzyme in a storage buffer and the qualitative evaluation of enzymatic activity allowed for a comprehensive assessment of the quality attributes of the enzyme stored for one month. The result obtained was an enzyme with a high degree of purity, specific and functional, retaining its activity even after one month of storage at temperatures of 4ºC and - 20ºC.Las pruebas moleculares representan una herramienta clave en el diagnóstico de diversas enfermedades, particularmente las que son de origen infeccioso. Durante la pandemia, estas pruebasse convirtieron en el pilar del diagnóstico debido a su versatilidad, rapidez, especificidad y sensibilidad pues permitieron implementar tratamientos y cercos epidemiológicos oportunos. La técnica de RT-qPCR permitió la detección del virus SARS- CoV-2; sin embargo, la abrumadora demanda de estas pruebas generó un desabastecimiento de suministros críticos, en particular, la enzima MMVL-RT, esencial para ejecutar la técnica. Por ende, en respuesta a esta escasez y con el objetivo de asegurar un suministro local de la retrotranscriptasa, la Universidad Icesi ha propuesto una metodología integral para su obtención y almacenamiento. Esta metodología abarca la producción, estabilización y evaluación de la enzima RT recombinante obtenida in-house a partir de Escherichia coli BL21(DE3). La secuencia de trabajo comprende la expresión de la enzima MMLV-RT en bacterias E. coli BL21(DE3), seguido de su purificación mediante cromatografía de afinidad utilizando una cola de histidina. Además, la formulación de la enzima en un buffer de almacenamiento y la evaluación cualitativa de la actividad enzimática permitieron una valoración exhaustiva de los atributos de calidad de la enzima almacenada durante un mes. El resultado obtenido fue una enzima con alto grado de pureza, específica y funcional, conservando su actividad incluso después de un mes de almacenamiento a temperaturas de 4ºC y -20ºC.2. INTRODUCCIÓN . . . . . 5 -- 3. METODOLOGIA . . . . . 11 -- 3.1 Producción de la enzima . . . . . 11 -- 3.1.1 Preparación de material y medios de cultivo . . . . 11 -- 3.1.2 Pre - inoculo . . . . . 12 -- 3.1.3 Expresión de la enzima MMLV RT recombinante . . . . 12 -- 3.1.4 Purificación de la enzima MMLV RT recombinante . . . 12 -- 3.1.5 Regeneración columna HisTrap TM FF 1 mL . . . . 13 -- 3.2 Determinación de formulación . . . . . 14 -- 3.3 Evaluación de la estabilidad de la enzima . . . . 14 -- 3.4 Atributos de calidad de la enzima . . . . 14 -- 3.4.1 Actividad biológica . . . . . 15 -- 3.4.2 Identidad de la proteína . . . . . 16 -- 3.4.3 Cuantificación de la proteína . . . . . 16 -- 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN . . . . . 17 -- 5. CONCLUSIONES . . . . . 30 -- 6. AGRADECIMIENTOS . . . . . 30 -- 7. REFERENCIAS: . . . . . 31Trabajo de Grado para obtener el título del Programa de Química Farmacéutica33 páginasDigitalapplication/pdfspaUniversidad IcesiBarberi de Ingeniería, Diseño y Ciencias AplicadasQuímica FarmacéuticaSantiago de caliEL AUTOR, expresa que la obra objeto de la presente autorización es original y la elaboró sin quebrantar ni suplantar los derechos de autor de terceros, y de tal forma, la obra es de su exclusiva autoría y tiene la titularidad sobre éste. PARÁGRAFO: en caso de queja o acción por parte de un tercero referente a los derechos de autor sobre el artículo, folleto o libro en cuestión, EL AUTOR, asumirá la responsabilidad total, y saldrá en defensa de los derechos aquí autorizados; para todos los efectos, la Universidad Icesi actúa como un tercero de buena fe. Esta autorización, permite a la Universidad Icesi, de forma indefinida, para que en los términos establecidos en la Ley 23 de 1982, la Ley 44 de 1993, leyes y jurisprudencia vigente al respecto, haga publicación de este con fines educativos Todo persona que consulte ya sea la biblioteca o en medio electróico podrá copiar apartes del texto citando siempre la fuentes, es decir el título del trabajo y el autohttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internationalhttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Producción, estabilización y evaluación de la enzima retrotranscriptasa recombinante obtenida a partir de Escherichia coli BL21(DE3)bachelor thesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fTrabajo de gradoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85info:eu-repo/semantics/bachelorThesisTodo PúblicoRetrotranscriptasaPruebas molecularesEnzimaDiagnosticoRT - PCREnzima MMLV - RTTrabajos de grado de Química FarmacéuticaReverse transcriptaseMolecular testsEnzymeDiagnosisRT - PCRMMLV - RT EnzymeWHO Coronavirus (COVID - 19) Dashboard | WHO Coronavirus (COVID - 19) Dashboard With Vaccination Data. https://covid19.who.int/.Du, J. et al. Optimal diagnostic test allocation strategy during the COVID - 19 pandemic and beyond. Stat Med 41 , 310 – 327 (2022).Semanal, B. E. 20 - 26 dic 2020. Boletín Epidemiológico Semana 52 .J. Farfán, B. M. BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA AL DIAGNÓSTICO CLÍNICO. Revista Médica Clínica Las Condes 26 , 788 – 793 (2015).Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/.Cebador. https:/ /www.genome.gov/genetics - glossary/Primer.¿Cuál es el papel del MgCl2 en las reacciones de amplificación por PCR? https:/ /www.excedr.com/resources/what - is - the - role - of - mgcl2 - in - pcr.Van Pelt - Verkuil, E., Van Belkum, A. & Hays, J. P. Principles and technical aspects of PCR amplification . Principles and Technical Aspects of PCR Amplification (Springer Netherlands, 2008). doi:10.1007/978 - 1 - 4020 - 6241 - 4.PCR: principio, pasos, tipos, componentes y aplicaciones de la PCR. https://byjus.com/biology/pcr/.Maga, G. Reverse Transcriptase. Brenner’s Encyclopedia of Genetics: Second Edition 222 – 223 (2013) doi:10.1016/B978 - 0 - 12 - 374984 - 0.01326 - 7.Coffin, J. M. & Fan, H. The Discovery of Reverse Transcriptase. Annu Rev Virol 3 , 29 – 51 (2016).Baneyx, F. & Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnology vol. 22 1399 – 1407 Preprint at https://doi.org/10.1038/nbt1029 (2004).Rosano, G. L. & Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology vol. 5 Preprint at https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00172 (2014).Park, J. H., Park, H. H., Choi, S. S. & Park, T. H. Stabilization of enzymes by the recombinant 30Kc19 protein. Process Biochemistry 47 , 164 – 169 (2012).A Crommelin Robert D Sindelar Bernd Meibohm Editors Fundamentals, D. J. Pharmaceutical Biotechnology .Bes, M. T., Gomez - Moreno, C., Guisan, J. M. & Fernandez - Lafuente, R. 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