Producción recombinante de la proteína Cas9 a partir de la expresión del plásmido pMJ922

La herramienta de edición genética CRISPR-Cas9, compuesta por una endonucleasa Cas9 y un RNA guía, ha revolucionado notablemente la biología molecular; sin embargo, encontrar la mejor alternativa para entregar sus componentes continúa siendo un reto en lo que respecta a temas como la capacidad de expresión o incluso de toxicidad. E. coli, cuyas ventajas lo convierten en un organismo de elección frecuente en la producción de proteínas recombinantes, constituye una alternativa para la obtención de la endonucleasa Cas9 necesaria durante la formación de ribonucleoproteínas. El objetivo de esta investigación consistió en establecer una metodología de producción de la proteína Cas9 en E. coli, a partir de la expresión del plásmido comercial Pmj922. Para llevar a cabo esta producción, el plásmido Pmj922, adquirido de forma comercial, fue extraído mediante soluciones miniprep a partir de células DH5α transformadas; posteriormente se confirmó la identidad del material genético mediante un perfil de digestión con las enzimas de restricción EcoRI y XbaI. La expresión de la proteína heteróloga se realizó en células BL21 termocompetentes transformadas que luego fueron cultivadas hasta una OD600 de 0.6, y se añadieron como inductores el IPTG e IPTG + Arabinosa. Finalmente, se hizo análisis de la expresión proteica por SDS-PAGE por medio de un gel de poliacrilamida al 7.5%. Los resultados muestran que se obtuvo una mayor expresión de la proteína Cas9 a una temperatura de 37°C en la prueba con los dos inductores, arrojando una banda diferencial en el gel de poliacrilamida.

• Autores: Meneses, Carlos E.; Restrepo, Santiago; Obando, Erika
• Fecha de publicación: 2023
• Institución: Universidad CES
• Repositorio: Repositorio Digital - Universidad CES
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repository.ces.edu.co:10946/7837
• Acceso en línea: https://hdl.handle.net/10946/7837
• Palabra clave: CRISPR-CAS9; E. coli; Proteínas heterólogas; Arabinosa; SDS Page
• Rights: closedAccess
• License: http://purl.org/coar/access_right/c_14cb