Targeted metabolomics por LC-MS/MS de la variación de carotenoides de Staphylococcus aureus asociados al estrés oxidativo y su relación con la fluidez de la membrana (2022)
La estafiloxantina (STX) es un sacarolípido derivado de un carotenoide presente en Staphylococcus aureus (S. aureus), implicado en la tolerancia al estrés oxidativo y la resistencia a péptidos antimicrobianos. Además, la STX influye en las propiedades biofísicas de la membrana bacteriana y ha sido asociada a la formación de dominios lipídicos durante la resistencia a la meticilina. Sin embargo, se desconoce como S. aureus regula la formación de STX y otros carotenoides, la tolerancia al estrés oxidativo por parte de estos metabolitos, así como sus implicaciones en la viscosidad de la membrana. Por ello, en esta investigación se desarrolló un método de cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para caracterizar simultáneamente todos los compuestos químicos asociados a la ruta biosintética de los carotenoides de S. aureus. Un total de 34 metabolitos relacionados a la biosíntesis de STX fueron identificados en una cepa silvestre, además se propuso una ruta biosintética alterna para la cepa SA147 que tenía inhibida la biosíntesis de los carotenoides, la cual se regeneró al contener el plásmido crtMN. La separación cromatográfica se obtuvo empleando columnas con rellenos C18 y C30, demostrando que la biosíntesis de los carotenoides se activa en la en la fase exponencial tardía (8h). Adicionalmente, el método LC-MS/MS permitió estudiar la conversión de carotenoides en el tiempo, evidenciando la progresión desde los precursores de carotenoides predominantes a las 8h de cultivo hasta la formación de los carotenoides finales en la fase estacionaria (24h). También se analizó la fase estacionaria tardía (48h) donde aumentó la proporción de células muertas, siendo STX uno de los componentes principales, pero no el único. Pues se elucidó un equilibrio químico entre el ácido 4,4'-diaponeouroesporenóico y STX durante la dinámica biosintética de los carotenoides, donde el sistema conformado por estas dos biomoléculas podría relacionarse como agentes reguladores de las propiedades biofísicas de la membrana bacteriana. Otro de los objetivos de esta investigación consistió en evaluar metodologías para la extracción de los carotenoides bacterianos, mediante la modernización del método clásico de extracción empleado por más de cuatro décadas, encontrando un incremento de significativo en los rendimientos. También se estudiaron métodos no convencionales de 18 extracción, siendo la extracción con líquidos presurizados (PLE) el método más selectivo a STX, al presentar los mejores rendimientos de recuperación cuando se utilizó etanol como disolvente. Estos resultados demostraron la posibilidad de reemplazar el metanol empleado en el método clásico por etanol, un disolvente que reduciría el impacto al ambiente. A su vez, se evaluó la capacidad antioxidante in vitro en cinco cepas de S. aureus mediante los ensayos DPPH y ORAC-lipofílico, demostrando que las cepas que producen carotenoides presentan la mejor capacidad antioxidante. Por otra parte, para evaluar la asociación entre la capacidad protectora de los carotenoides a condiciones de estrés y su incidencia en las propiedades de la membrana bacteriana, se determinó la viabilidad celular entre cepas que sintetizan carotenoides de las que no lo hacen. Encontrando una diferencia de un orden de magnitud en las unidades formadoras de colonias (UFC) cuando cepas de S. aureus y S. carnosus (contiene genes productores de carotenoides de S. aureus) fueron expuestas a una fuente generadora de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (plasma atmosférico frío, CAP), usado como método bactericida en infecciones cutáneas y bucales. Asimismo, la disminución estadísticamente significativa de los carotenoides cuantificados por el método LC-MS/MS indicó la eficiencia de CAP en degradar estos metabolitos en ambas bacterias. Además, el análisis de permeabilización de la membrana demostró una menor concentración de iones potasio liberado en las cepas productoras de carotenoides después de ser expuestas a CAP. Al analizar los extractos obtenidos después del tratamiento con CAP, ambas bacterias presentaron mayor fluidez debido a la oxidación de los carotenoides. Asimismo, al evaluar la concentración de carotenoides en las cepas de S. aureus expuestas a desecación durante uno y siete días, se demostró que la resistencia a desecación está relacionada con la mayor concentración de carotenoides, medición que también fue realizada con el método LC-MS/MS desarrollado. Adicionalmente, se determinaron las cantidades de los ácidos grasos mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Estos análisis mostraron que los ácidos grasos de mayor abundancia en la membrana bacteriana tienen cadenas de 15 y 17 unidades de carbono, coincidiendo con los homólogos principales de STX, 19 los cuales fueron caracterizados por LC-MS/MS. Asimismo, se identificaron ácidos grasos entre 10 a 22 unidades de carbonos, algunos de las cuales también se encuentran enlazados al núcleo de STX, identificados por LC-MS/MS. Por último, empleando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) en sistemas de lípidos modelo (incluido un lípido deuterado) y sistemas in vivo, se confirmó que los carotenoides contribuyen a modular las propiedades biofísicas en la membrana de S. aureus. Se determinó que los carotenoides aumentan la rigidez de la membrana bacteriana a la temperatura de crecimiento (37°C) correspondiente a la fase líquido cristalina, que coincide a lo reportado usando sondas fluorescentes. Al mismo tiempo, los resultados FTIR también demostrarían que, con el aumento de la concentración de los carotenoides en la bacteria a bajas temperaturas ocurre un cambio en las temperaturas de transición (Tm) entre la fase gel y la líquido-cristalina, tornándose más fluida la membrana, algo por primera vez reportado para S. aureus. Resultados que confirmarían lo que se ha planteado para STX, carotenoide que cumpliría funciones semejantes al colesterol en células eucariotas, mientras que a altas temperaturas aumenta el nivel de empaquetamiento generando estabilidad, a bajas temperaturas se evita la agrupación de fosfolípidos por intercalación entre las colas lipídicas. En conclusión, mediante metodologías LC-MS/MS enfocadas al análisis de los carotenoides de S. aureus, así como el desarrollo de ensayos químicos y microbiológicos, fue posible elucidar la dinámica bioquímica que ocurre durante la biosíntesis metabólica de estos compuestos. Incluyendo la identificación de su diversidad molecular, comprendiendo con mayor detalle las propiedades de tolerancia a condiciones de estrés oxidativo asociadas a estos carotenoides. Sumado al estudio sobre el impacto que tienen en las propiedades biofísicas de la membrana bacteriana mediante análisis in vivo y con lípidos modelo empleando FTIR, sin la necesidad de sondas adicionales que se utilizan en métodos fluorescentes.