Staining and extraction protocol for lipid droplets in malassezia globosa and analysis of consumed and secreted lipids during the growth phase (2020)
Malassezia es un género de levaduras lipido-dependientes presentes en la microbiota de la piel de humanos y animales, asociadas con diferentes trastornos cutáneos. A pesar de la alta prevalencia de estas enfermedades, aun queda mucho por descubrir sobre sus procesos fisiopatológicos. Dentro de su metabolismo lipídico, recientemente se reportó la presencia de lipid droplets (LD). Teniendo en cuenta la dependencia lipidca de Malassezia, se ha dirigido un interés particular al estudio de LD. En este proyecto se realizó la estandarización de un protocolo de doble tinción para identificar LD, un protocolo de extracción de LD, la dinámica de LD en M. globosa y el análisis de lípidos consumidos y secretados de la levadura. Para lograr estos objetivos, se utilizaron tres fluoróforos diferentes para la tinción de LD. Posteriormente, se exploró la dinámica de LD. Se encontró que los LD comienzan a formarse durante la fase de crecimiento exponencial. Además, los números de LD por célula disminuyen cuando entra a la fase estacionaria. También se observó un aumento en la proporción de LD frente al área de la levadura en el tiempo. Con base en estas observaciones, se propone que los LD se aglomeran en el crecimiento de M. globosa. Por otro lado, el protocolo de extracción de LD se implementó debidamente en M. globosa, pero aún se requieren pasos adicionales de purificación. Para estudiar los patrones de secreción/consumo, se estudió mDixon fresco y sobrenadante de mDixon de la levadura cultivada. La extracción de lípidos se realizó mediante un método de Bligh y Dyer modificado y SPE. El análisis lipidómico se realizó mediante HPLC-ESI-QTOF en modo de ionización positivo. El análisis mostró la presencia de diferentes fosfolípidos, cardolipinas, ácidos biliares y ceramidas. En general, hubo un mayor porcentaje de lípidos consumidos por M. globosa en comparación con los lípidos secretados. Se necesitan más análisis para confirmar la identidad de cada lípido individual