Relación del gen FOXP3 en el espectro de la neuromielitis óptica: Metodología y validación de la técnica para su cuantificación (2021)
El espectro de la neuromielitis óptica (NMOSD) es una enfermedad autoinmune y desmielinizante del sistema nervioso central. El 90% de los pacientes presentan autoanticuerpos contra la inmunoglobulina G acuaporina-4 (AQP4 IgG). Se conoce que los linfocitos Th17 están asociados con anticuerpos AQP4. La respuesta de estos linfocitos Th17 son restringidos por subconjuntos de células T-reg. El subconjunto de células T-Reg más conocido se caracteriza por el factor de transcripción del gen FoxP3. En diversos estudios se ha reportado una disminución significativa en la expresión del gen FoxP3 en pacientes con NMOSD. En Colombia debido al poco conocimiento que se tiene sobre la enfermedad es importante adelantar estudios que aporten más a la investigación de la afectación. Por eso, en este estudio se buscó validar y estandarizar la técnica de RT-qPCR para la cuantificación del gen FoxP3 en muestras de sangre completa con el fin de aportar a investigaciones sobre la participación de las células T-reg en NMOSD. Se estandarizaron los protocolos de extracción de RNA y síntesis de cDNA para mejorar la cantidad de muestras obtenidas. Además, se evaluaron condiciones adicionales como, los parámetros del diseño de primers, y las condiciones del termociclador. Por último, para el análisis de datos se estimó la eficiencia de la PCR obteniendo resultados > al 100% para el gen Foxp3 y < al 100% para el Hosekeeping. Asi mismo, se observó que la implementación de b-ME mejoraba la obtención de RNA mientras que con Trizol no se obtenían mejores resultados. La reacción de PCR entro a la fase exponencial luego de 28 ciclos debido a las concentraciones bajas de la muestra. Se conoce que el buffer de Mini Kit RNeasy (Qiagen) interfieren en la obtención de grandes cantidades de RNA. De igual modo, se recomienda cuantificar el cDNA, aumentar la temperatura anillaje/elongación a 62 grados, aumentar el número de ciclos que corre la PCR y prolongar el tiempo de la enzima en el protocolo de cDNA.