Evaluación del comportamiento de la actividad enzimática de la carbapenemasa KPC en aislamientos de Pseudomonas aeruginosa por medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (2023)
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, no fermentadora de la lactosa, aerobio de tipo facultativo (1). Es bastante persistente en el ambiente, puede llegar a adaptarse de manera eficaz en el agua y en el suelo, viviendo con requerimientos nutricionales mínimos y tolerando diversas condiciones físicas. Es considerada un patógeno oportunista, generando infecciones en los humanos que si no son tratadas a tiempo pueden ser mortales, con resistencia natural a varias familias de antibióticos y una extraordinaria capacidad de generar y adquirir diversos mecanismos de resistencia, entre ellos las carbapenemasas, enzimas con actividad para degradar los antibióticos carbapenémicos (pertenecientes a los β-lactámicos) usados como último recurso frente a la “multirresistencia extrema” de las bacterias. En Colombia fue reportado por primera vez un aislamiento de P. aeruginosa portadora de la enzima KPC (2) (EC 3.5.2.6) (3) una potente carbapenemasa capaz de hidrolizar los carbapenémicos y la mayoría de los antibióticos β-lactámicos. Actualmente, esta enzima es la más frecuente en aislamientos resistentes a los carbapenémicos, lo cual podría sugerir su eficiente capacidad de hidrólisis. Por tal razón, el objetivo de este proyecto es evaluar el comportamiento de la actividad enzimática de KPC en el proceso de hidrólisis de antibióticos carbapenémicos en aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa por medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Las muestras fueron facilitadas y/o recuperadas de instituciones de salud colombianas, estos aislamientos (24Pae112, 34Pae8, 34Pae23, 34Pae36, 30Pae2) fueron sometidos a pruebas de confirmación de especie y de presencia del gen que codifica para KPC por medio de técnicas moleculares como PCR. Posteriormente, por medio del espectrofotómetro, se evaluó la capacidad de hidrólisis de cada uno de los aislamientos; para esto, se realizaron ensayos de reacción enzimática con 30 µg/mL de MER ™ y 9x10^8 UFC de bacteria total a 37°C y después de 10 minutos de reacción hubo una reducción gradual del sustrato en orden cero, en un rango del 20%-50% con diferencias estadísticas significativas (P<0,05) entre cada uno de los aislamientos. A su vez, se evaluó este comportamiento con extracto proteico en espectrofotómetro y se evidenció que después de 18 minutos de reacción a temperatura ambiente, con 30 µg/mL de MER ™ y 2 mg de proteína, hubo una degradación gradual del sustrato en orden cero, en un rango del 77%-98%. Teniendo en cuenta lo obtenido previamente, y entendiendo que la técnica de cromatografía permite cuantificar a un límite de detección bajo (en el orden de µg), se realizó la medición en el equipo HPLC partiendo de 80 µg/mL de M2574-50mg y 2 mg de proteína, obteniéndose una reducción del 51%-99% del sustrato inicial; en ambos equipos se presentaron diferencias estadísticas significativas (P<0,05) entre cada uno de los aislamientos. De acuerdo con los resultados obtenidos, se concluye que los aislamientos evaluados presentaron una notable capacidad de hidrólisis del sustrato y que los ensayos tanto con bacterias totales como con extracto proteico revelaron reducciones significativas en orden cero, con un rango de reducción que oscila entre el 20% y el 98%, lo que sugiere una eficaz actividad enzimática por parte de KPC. Además, la cuantificación que se llevó a cabo por medio de las dos técnicas empleadas mostró una reducción considerable del sustrato, respaldando aún más la actividad enzimática observada. Estos resultados subrayan la importancia de comprender la actividad de la enzima y tienen implicaciones significativas en el contexto de la resistencia antimicrobiana y la evaluación de nuevos compuestos farmacológicos