Protocolo para infección de células EA.hy926 por distintas cepas de citomegalovirus humano y determinación del establecimiento de latencia (2020)
Antecedentes: La infección in vivo de células endoteliales por citomegalovirus tiene un papel fundamental en el desarrollo de patologías asociadas con este virus; permite la replicación viral, el establecimiento de latencia y facilita el paso del virus desde la sangre a los tejidos. Los estudios que evalúan la latencia se realizan en cultivos primarios y no en líneas celulares como EA.hy926 y normalmente se emplean cepas de laboratorio. Objetivo: Estandarizar un protocolo de cultivo e infección de células Eahy926 con cepas de HCMV y determinar el establecimiento de latencia. Metodología: Las células EA.hy926 se cultivaron en DMEM + SFB al 10% + antibiótico - antimicótico al 2%, se incubaron en una atmósfera de CO2 al 5% y 37ºC. Estas células se tomaron en pasaje doce. Cuando alcanzaron una confluencia del 90%, se sembraron en placas de 12 pozos, 60,000 por pozo. Después de 24 horas, se infectaron con Towne y un aislado clínico con un MOI de 0.1 y 0.5. Se centrifugaron a 337g durante 30 minutos a 25 ° C, se incubaron durante 2 horas a 37 ° C. Se retiró el inóculo y se adicionó medio fresco. Las células fueron evaluadas a las 24, 48, 72 y 96 horas postinfección. Resultados: El establecimiento de infección de Towne se detectó por PCR a un MOI de 0.1 a las 48 y 96 horas posinfección. Se observó efecto citopático a un MOI de 0,5 a las 48, 72 y 96 horas posinfección. No se observó efecto citopático en las células infectadas con el aislado clínico en los tiempos evaluados. La latencia se puede determinar mediante RT-PCR para los genes UL138, UL111A, UL81-UL82, US28 o por inmunofluorescencia indirecta para la proteína UL138 o para IE1 /2 que no se debe detectar si se establece latencia. Conclusiones: El modelo de infección en células EA.hy926 es una buena alternativa para el estudio de infección latente en células endoteliales y es una opción segura y económica. La infección lítica por Towne se puede detectar en las células EAhy926, con los MOI y tiempos evaluados. El mismo resultado no se observó con el aislado clínico.