Establecimiento de un cultivo en suspensión del musgo Polytrichum juniperinum y evaluación de su potencial para la producción de compuestos bioactivos (2015)
El tejido protonemal de musgos en suspensión ha sido reconocido como una plataforma deseable de producción de proteínas recombinantes debido a sus notables ventajas. Sin embargo, actualmente hacen falta estudios en donde se evalúe su potencial para la producción de metabolitos de alto valor agregado. En esta tesis se estableció por primera vez un cultivo de tejido protonemal de Polytrichum juniperinum y se evaluaron los efectos del medio de cultivo basal, condiciones tróficas, pH inicial, tamaño del inóculo, longitud de onda de la luz y la disrupción mecánica del tejido sobre su crecimiento, con el propósito de mejorar la bioproductividad del cultivo. Además se realizó un análisis fitoquímico y se evaluó la actividad antibacteriana y citotóxica del protonema creciendo en suspensión, como evidencia de la producción de compuestos bioactivos de alto valor. La tasa específica de crecimiento máxima y el contenido de compuestos fenólicos no presentó diferencias entre los medios MS, Knop, PPNH4, aunque si se observó un efecto sobre la diferenciación del tejido. El protonema mostró capacidad para crecer en suspensión en condiciones mixotróficas y heterotróficas utilizando sacarosa como fuente de carbono orgánico, sin necesidad de una adaptación previa del tejido. Se observó un aumento de tres veces en la tasa específica de crecimiento en condiciones mixotróficas, alcanzando densidades celulares elevadas (11 g/L) y se evidenció la secreción de azúcares simples al medio durante la fase exponencial de crecimiento. Por otra parte, este estudio demostró que el protonema de P. juniperinum es tolerante a un amplio intervalo de pH inicial (4.5 a 8) cuando se cultiva en medio MS. Bajo condiciones mixotróficas y fotoautotróficas el aumento en el tamaño del inóculo de 45 mg/L a 300 mg/L resultó en una disminución del índice de crecimiento, contrario a las condiciones heterotróficas en las cuales no se encontraron diferencias entre los diferentes tamaños de inoculo evaluados. El uso de diferentes concentraciones de sacarosa no afectó el crecimiento del protonema, sin embargo si generó un efecto sobre la diferenciación del tejido, como un efecto combinado con el tamaño del inóculo. En adición, se encontró que la variación en la longitud de onda de la luz afecta notablemente el crecimiento del protonema en suspensión de P. juniperinum, obteniéndose un índice de crecimiento significativamente mayor para el espectro de luz azul o blanco seguido por el rojo, verde o amarillo y oscuridad en condiciones fotoautotróficas. Esta variación también tuvo efectos sobre la composición de la biomasa, encontrándose un mayor contenido de clorofilas, carotenoides y terpenoides totales en los cultivos expuestos a luz blanca y un menor contenido en aquellos expuestos a luz azul, aunque no se encontraron diferencias significativas en el contenido de compuestos fenólicos totales entre ellos. Finalmente, la disrupción mecánica del tejido durante 15 y 60 segundos indujo un estallido oxidativo temporal que a su vez podría tener un efecto directo sobre la activación del metabolismo secundario, evidenciado por una acumulación en el contenido de compuestos fenólicos totales en el tejido con respecto al control. Sin embargo, el protonema recuperó su actividad metabólica ya que no se encontraron diferencias significativas en el índice de crecimiento entre los dos tiempos de exposición y el control. También se encontró actividad antibacteriana y citotóxica contra la línea celular CHO de extractos provenientes tanto del protonema en suspensión como del musgo creciendo en condiciones naturales, siendo los más promisorios los extractos de acetato de etilo y diclorometano. Se determinó la presencia de saponinas, terpenoides y flavonoides en el tejido creciendo en suspensión y se encontraron 5 compuestos relacionados con flavonoides mediante HPLC, los cuales no pudieron ser identificados. Los resultados de este estudio confirman que es factible utilizar las suspensiones del tejido protonemal de musgos como una plataforma de producción de compuestos bioactivos, tales como sustancias antimicrobianas y anticancerígenas. Este trabajo también hace un aporte al conocimiento de este tipo de suspensiones celulares con respecto a la caracterización de su crecimiento mediante la evaluación de diferentes factores, con el fin de mejorar la bioproductividad del cultivo, como una clave para su futura aplicación biotecnológica a gran escala.