Clonación y determinación de la especificidad iónica de CtpA, una ATPasa tipo P encargada de transportar metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis (2013)
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa que representa uno de los mayores retos de salud pública en el mundo. Actualmente, su tratamiento no es efectivo debido al surgimiento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (agente etiológico de la enfermedad) resistentes a los fármacos antituberculosos convencionalmente utilizados. Tradicionalmente las enzimas de la membrana plasmática se han asociado con los fenómenos de resistencia en bacterias debido que algunas de ellas se encargan del eflujo de sustancias toxicas. Entre ellas, las ATPasas tipo P1B han sido de gran interés debido a que están involucradas en el transporte de metales pesados que afectan el crecimiento celular. En el caso de algunas bacterias patógenas, algunas ATPasas tipo P1B se han considerado como posible factores de virulencia debido a su papel en la adaptación que del patógeno en el ambiente intracelular. En comparación con otros sistemas bacterianos el genoma de M. tuberculosis H37Rv (cepa de referencia) contiene un gran número de ATPasas tipo P1B. Mediante herramientas bioinformáticas ha sido posible realizar una aproximación para conocer los sustratos transportados por estas enzimas, logrando de esta forma identificar la relación de las proteínas CtpA, CtpB y CtpV con el transporte de Cu+; el de CtpC y CtpG con el transporte Zn2+; y el de CtpD y CtpJ con el transporte de Co2+. Estudios anteriores han reportado que ctpA hace parte del grupo de genes que M. tuberculosis sobreexpresa durante la infección in vivo. Específicamente se evidenció el aumento de la expresión del gen ctpA en cepas de M. tuberculosis multiresistentes y extremadamenteresistentes productoras de TB pulmonar o extrapulmonar, sugiriendo que CtpA es una enzima importante para el progreso de la infección tuberculosa. El objetivo del presente proyecto ha sido conocer la especificidad iónica de CtpA, encaminado a conocer su posible papel en la dinámica de infección tuberculosa. Los resultados obtenidos han mostrado que la sobreexpresión heteróloga de CtpA de M. tuberculosis le induce a M. smegmatis mc2155 tolerancia a niveles tóxicos de Cu2+ (4 mM). Se postula que posiblemente el Cu2+ que ingresa a la micobacteria es reducido a Cu+ debido al carácter fuertemente reductor del interior celular; además que una vez reducido el Cu sufre un eflujo al exterior de la micobacteria. Por otro lado, ensayos de actividad ATPasa mostraron que la presencia de Cu+ (4,9 U/mg de proteína) y Ni2+ (2,1 U/mg de proteína) estimula la actividad ATPasa en vesículas de membrana plasmática de M. smegmatis enriquecidas con CtpA. Finalmente, se determinaron los parámetros cinéticos de la actividad de CtpA sobreexpresanda en vesículas de membrana, encontrando que la enzima presenta condiciones óptimas de reacción enzimática a 37 °C y un pH de 7,9. Se encontró que las contantes cinéticas aparentes de CtpA son K1/2 de 4,68 x 10-2 μM de Cu+, Vmax 10,3 U/mg de proteína y h de 1,91. El conjunto de resultados obtenidos sugieren que CtpA es una Cu+ ATPasa tipo P que tiene como función desintoxicar a la célula cuando se enfrenta a niveles letales de Cu+. Adicionalmente, se construyó un sustrato de intercambio alélico y la cepa de recombinería para obtener una cepa mutante defectiva en el gen ctpA de M. tuberculosis H37Ra, mediante la técnica de recombinería, que en un futuro cercano permitirá contrastar los resultados obtenidos en el presente trabajo, y ampliar acerca del transporte de Cu+ mediado por ATPasas tipo P en M. tuberculosis H37Rv.