Evaluación de la capacidad inmuno-estimulante de la terapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama (2017)
La evidencia experimental en modelos de cáncer en animales y estudios clínicos en pacientes con cáncer, sugieren que ciertos regímenes de quimioterapia o radioterapia estimulan el sistema inmune. La Doxorrubicina es un agente quimioterapéutico ampliamente estudiado por su capacidad de inducir muerte celular inmunogénica en células tumorales, un tipo de muerte celular que probablemente favorece la presentación cruzada de antígenos tumorales por células dendríticas (DCs) necesaria para la inmunidad anti tumoral mediada por linfocitos T (LT)-CD8+. Por otra parte, varios informes indican que la Ciclofosfamida utilizada a bajas dosis en pacientes con cáncer reduce el número de LT-CD4+ supresores FoxP3+ (Tregs). A pesar de que el tratamiento con Doxorrubicina y Ciclofosfamida (esquema de quimioterapia A/C) se utiliza ampliamente en nuestro país para el tratamiento neo-adyuvante de pacientes con cáncer de mama, el efecto inmuno-estimulante del tratamiento con A/C en estas pacientes está pendiente de ser demostrado. En un esfuerzo por revelar el efecto inmuno-estimulante de la terapia antitumoral, en esta tesis se implementó un sistema de inmuno-monitoreo de leucocitos de sangre de pacientes con cáncer de mama, que permite establecer correlación entre la respuesta clínica de las pacientes a la quimioterapia con algunos fenotipos funcionales de respuesta inmune celular evaluados in vitro. Para establecer este sistema de inmuno-monitoreo fue necesario optimizar en primer lugar, condiciones in vitro que permitiesen cotejar en sangre periférica de una paciente antes y después de la terapia antitumoral distintas funciones en LT (CD4+ y CD8+) específicos de antígenos tumorales, los cuales se encuentran habitualmente en muy bajo número en sangre de pacientes con cáncer. La etapa de implementación estuvo seguida de la validación de la utilidad del monitoreo de estas funciones celulares en células de un grupo de pacientes con cáncer de mama obtenidas antes y después de tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C con la capacidad de la terapia antitumoral de restablecer algunas funciones de la respuesta inmune celular. El inmuno-monitoreo de las células de las pacientes con cáncer de mama se realizó en gran medida por el análisis manual de datos de citometría de flujo (CF) multi-paramétrica que permite cuantificar múltiples parámetros y fenotipos celulares en las poblaciones celulares analizadas. Sin embargo, la disponibilidad reciente de nuevos algoritmos bio-informáticos como SPADE, FLOCK, tSNE, y más recientemente CITRUS, que proporcionan nuevas herramientas visuales y estadísticas para el análisis automatizado multidimensional de datos obtenidos por CF los cuales han sido empleados hasta ahora para el análisis jerárquico de la diferenciación de células derivadas de médula ósea y células inmaduras en pacientes con leucemia, fueron utilizados para el análisis multidimensional de las células de las pacientes en muestras antes y después de la quimioterapia tanto ex vivo como en respuesta a un estímulo in vitro. Los resultados de esta tesis muestran que el sistema de inmuno-monitoreo implementado permite evidenciar una asociación entre la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia con A/C con una recuperación de la funcionalidad de la respuesta inmune celular en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante. Consideramos que la restitución de algunas funciones analizadas en LT y DCs en respuesta al tratamiento podrían tener valor predictivo de la respuesta clínica del tumor previo a la aplicación de la quimioterapia neo-adyuvante con A/C. Metodología Para implementar el modelo de inmuno-monitoreo, fue necesario establecer diferentes condiciones de cultivo in vitro que permitiesen evidenciar la funcionalidad de LT y células presentadoras de antígeno (APC) en muestras de sangre periférica obtenidas de donantes sanas como de pacientes con cáncer de mama antes y posterior al tratamiento con tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C. Inicialmente se optimizó la generación de dos tipos diferentes de DCs maduras derivadas de monocitos en dos días (tipo estándar y tipo alfa), necesarias para activar respuestas Th1, citotóxicas y foliculares. Estas DCs se emplearon en dos sistemas de cultivo in vitro implementados con el fin de evaluar, el primero la respuesta de LT de memoria específicos de antígenos tumorales y el segundo para determinar la presencia de LT específicos de estos antígenos dentro del compartimento de LT vírgenes. Por otra parte, se midieron la frecuencia y estatus inmunológico de dos sub-poblaciones de DCs, de LT-CD4 FoxP3+ reguladores y Células Supresoras de Origen Mieloide (MDSCs) ex vivo y el grado de respuesta al estímulo de LT y de DCs in vitro. Los resultados de CF se analizaron tanto por la estrategia manual (software FlowJo) como con el empleo de algoritmos automatizados como FLOCK, SPADE y CITRUS con el fin de establecer correlación entre los resultados de estos análisis con la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia.   Resultados La implementación del sistema de inmuno-monitoreo de individuos sanos y de pacientes con cáncer de mama permitió establecer la utilidad como APCs profesionales de dos fenotipos funcionales de DCs derivadas de monocitos en dos días cuyas características fenotípicas y funcionales son indistinguibles de DCs clásicas derivadas en siete días. La evaluación de LT específicos de antígenos en una paciente “modelo” en remisión completa luego de nueve años de tratamiento antitumoral, permitió evidenciar que LT-CD8+ específicos de un antígeno tumoral que infiltraban el tumor al momento del diagnóstico experimentaron un incremento de su frecuencia en sangre varios meses después de la terapia antitumoral. El monitoreo en esta paciente evidenció un fenotipo de inmunosupresión de los componentes APCs y LT. Mientras las APCs mostraron una deficiente respuesta a estímulos pro-inflamatorios y secreción de IL-12p70, los LT respondieron de manera deficiente en respuesta a la estimulación del TCR. De manera notable, estas evidencias de la deficiente respuesta inmune celular en esta paciente se recuperaron de manera significativa luego de la terapia antitumoral. Por su parte el monitoreo de APCs y LT en el grupo de pacientes antes de tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C reveló las mismas deficiencias funcionales en APCs y LT observadas en la paciente “modelo” previo a la terapia antitumoral. Luego de instaurada la terapia neo-adyuvante con A/C la funcionalidad de estas células alcanzó niveles similares a los observados en las células de mujeres sanas, más aún, en estas pacientes la recuperación de algunos fenotipos funcionales pudo ser correlacionada de manera predictiva con la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia con A/C. Finalmente, el análisis automatizado del inmuno-monitoreo con SPADE, FLOCK y CITRUS, permitió confirmar los resultados obtenidos con el análisis manual y además establecer el fenotipo de poblaciones complejas que diferencian el grado de respuesta inmune de personas sanas de muestras obtenidas de pacientes con cáncer de mama. Conclusiones Tomados en conjunto, los resultados obtenidos permiten proponer un modelo de inmuno-monitoreo como herramienta útil para evidenciar en muestras de sangre de pacientes con cáncer de mama la capacidad inmuno-estimulante de la quimioterapia con A/C. Algunos de los parámetros analizados permiten predecir con base en la respuesta funcional del sistema inmune antes de iniciado el tratamiento el grado de respuesta clínica de las pacientes al tratamiento con A/C. Los algoritmos de análisis automatizado son aplicables para los análisis de CF complejos facilitando el procesamiento de múltiples muestras y la identificación de sub-poblaciones celulares que pudiesen ser utilizadas como posibles bio-marcadores característicos del estatus de LT pre-quimioterapia. Este modelo de inmuno-monitoreo actualmente se utiliza para el seguimiento de la respuesta a la vacunación con DCs en el primer ensayo clínico de inmunoterapia fase I/II en nuestro medio en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante con A/C.