Contribución al Estudio de Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DHPD) de la Ruta Catalítica de Pirimidinas en Oryza Sativa L. (2016)
El arroz es un alimento esencial dentro de la canasta familiar lo que lo hace uno de los cereales más consumidos, pese a esto, en los últimos años se han evidenciado cambios climáticos severos como altas temperaturas y continuas precipitaciones que afectan el crecimiento, reproducción y ciclos vitales de las plantas dado por la disminución en la captación de nutrientes a través del suelo (Peñuelas, 2004), lo cual conlleva a que estos factores abióticos representen una gran problemática, ya sea en la estructura de la planta o en las diferentes rutas metabólicas ocasionando una expresión muy alta o muy baja de ciertos genes regulados implicados en la tolerancia frente al estrés abiótico como mecanismo de defensa en la planta de arroz (Soren, 2010). Una de las rutas presentes en la tolerancia frente a factores abióticos como sequía y salinidad podría ser la ruta de pirimidinas, ya que, se ha reportado una sobre expresión frente a este tipo de estrés en la primera enzima de degradación de pirimidinas la Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DHPD) (Liu et al. 2009). La proteína se ha estudiado en hígado de cerdo demostrando que está conformada por 5 dominios siendo uno de ellos una subunidad donde FMN y NADPH se acoplan (Dobritzsch, et al. 2002), y que en plantas se desconoce, por lo que la DHPD tiene reportada tan solo la mitad del tamaño en comparación a la DHPD de mamíferos, faltando la subunidad en la que se ensambla NADPH y se da el transporte de electrones desde este al sustrato (Zrenner et al., 2006). Esto sugiere que en plantas se requiere de una interacción entre DHPD y la proteína que se encargue de la transferencia de electrones para un óptimo funcionamiento en la vía de degradación de Uracilo o Timina; sin embargo, esto no ha sido reportado para ninguna especie vegetal. Un posible candidato del fragmento carente es la β-subunidad de Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato-Glutamato Sintasa (NADPH-GltS) por su homología reportada en bancos de secuencias con el segmento faltante de DHPD (Vanoni et al. 1999). A partir de esto, el trabajo realizado tuvo como fin obtener los genes que posiblemente hacen parte de la subunidad complementaria al dominio de la proteína DHPD de la ruta de degradación de pirimidinas en Oryza sativa L. y así contribuir a futuros estudios con esta enzima y su importancia en la tolerancia frente al estrés abiótico ocasionado por salinidad y altas sequias que trae consigo los problemas climáticos que actualmente se presentan. Para esto, se clonaron las dos isoformas de la β-subunidad de NADH-GltS en el vector de expresión pET19b para futuros ensayos de complementación entre las Isoformas de la β-subunidad de NADH-GltS y la DHPD. La clonación se realizó mediante la extracción de ARN en plantas de arroz y posteriormente de obtuvo ANDc, desde este se diseñaron primers que funcionen como templado para la amplificación de las secuencias de las dos isoformas de la β-subunidad de NADH-GltS. La β-subunidad de NADH-GltS 1 se clonó en vector de expresión pET-19b utilizando tanto para la secuencia de NADH-GltS 1 como para el vector la enzima de restricción XhoI. Los fragmentos fueron purificados con QIAquick Gel Extraction Kit de QIGEN, para posterior ligación y transformación en células quimicompetentes DH5α. En el caso de la β-subunidad de NADH-GltS 2 se realizó el mismo procedimiento pero cambiando las enzimas de restricción, empleando XhoI y BamHI para la secuencia y el vector pET-19b. Finalmente se obtuvo la clonación de la β-subunidad de NADH-GltS 1 corroborándose mediante PCR, restricción enzimática y secuenciación de los clones. Sin embargo, la clonación de la β-subunidad de NADH-GltS 2 no se consiguió debido a la similitud entre las isoformas planteando posibles estrategias a partir de los primers para próximos estudios. Por último, se dejaron creciendo las bacterias transformadas de la isoforma 1 en medio LB para realizar congelados de las mismas con la finalidad de preservar las secuencias de interés. Como conclusión de esta investigación se obtuvieron células transformadas con la β-subunidad de NADH-GltS 1, estas contribuirán a estudios de interacción entre el posible dominio transferente de electrones y la enzima DHPD correspondiente a la primera ruta de degradación de pirimidinas en Oryza sativa L, proporcionando herramientas para investigaciones de la ruta y la expresión de la enzima al ser sometida a factores de estrés abiótico como sequía y salinidad. Como conclusión de esta investigación se obtuvieron células transformadas con la β-subunidad de NADH-GltS 1, estas contribuirán a estudios de interacción entre el posible dominio transferente de electrones y la enzima DHPD correspondiente a la primera ruta de degradación de pirimidinas en Oryza sativa L, proporcionando herramientas para investigaciones de la ruta y la expresión de la enzima al ser sometida a factores de estrés abiótico como sequía y salinidad.