Perfil proteico de vesículas extracelulares en artritis reumatoide : influencia de la seropositividad y la actividad de la enfermedad (2025)
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la inflamación crónica de las articulaciones. La detección o ausencia de los autoanticuerpos dirigidos contra péptidos citrulinados (ACPA) y el factor reumatoide (FR), divide a los pacientes en seropositivos (SP) y seronegativos (SN), respectivamente. Los SP típicamente presentan peor pronóstico y cambios fenotípicos en vesículas extracelulares (VE) derivadas de sangre y líquido sinovial, en comparación con pacientes SN e individuos sanos. Las VE son partículas delimitadas por una bicapa lipídica que pueden ser generadas por cualquier tipo de célula. En el contexto de la AR, estas estructuras son consideradas fuentes importantes de autoantígenos y alarminas, que contribuyen con el ambiente proinflamatorio característico de la enfermedad. Se ha demostrado in vitro que las VE de pacientes SP son potentes inductoras de la producción de TNF-α, IL-1B e IL-6 por parte de fagocitos mononucleares en comparación con las VE de individuos sanos y pacientes con lupus eritematoso sistémico. Por lo tanto, se propone que las VE de los pacientes con AR deben tener un contenido particular de proteínas, que contribuye con la inflamación sistémica. Para evaluar esto, en el presente trabajo se determinó y comparó el contenido proteico total de VE aisladas de sangre periférica de pacientes con AR, de acuerdo con las clasificaciones de la enfermedad basadas en seropositividad y actividad de la enfermedad y en contraste con donantes sanos (HD). Se colectó sangre venosa periférica de 18 HD y 44 pacientes con AR clasificados de acuerdo con la seropositividad (en SN o SP) y el estado de actividad de la enfermedad (en inactivo/remisión o enfermedad activa, basado en el puntaje DAS28). El estado de inflamación sistémica se estimó mediante la medición en suero de las citoquinas TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12p70. Las VE fueron enriquecidas a partir de plasma mediante centrifugación diferencial y filtración. Se caracterizaron siguiendo las recomendaciones de la “Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares” (ISEV) en fresco por citometría de flujo, con el fin de determinar tamaño, concentración, presencia de bicapa lipídica, marcadores de superficie, presencia de péptidos citrulinados y formación de complejos inmunes. Adicionalmente, la estructura, recuento y tamaño de las VE también se evaluó luego de su criopreservación usando microscopia electrónica, análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y western blot. Posteriormente, se seleccionaron VE de al menos 4 individuos por cada grupo experimental, y se cuantificó el contenido total de proteínas mediante el método de ácido bicinconínico (BCA). Los análisis proteómicos se realizaron por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem. Se ejecutaron comparaciones entre grupos relevantes, y se aplicó el logaritmo base 2 de las veces de cambio (fold change, FC) a los datos. El análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) fue usado para calcular los índices de ‘importancia de la variable en la proyección’ (VIP) y el índice de ‘correlación multivariante significativa’ (sMC). Se identificaron las proteínas que mejor discriminaron a cada grupo de estudio y se realizaron análisis estadísticos no paramétricos, análisis de correlación y de ontología de genes. Las proteínas más importantes en las VE de pacientes con AR se seleccionaron de acuerdo con los siguientes criterios: estar en los 20 puntajes VIP y sMC más altos, tener un valor absoluto de FC ≥ 0.6 en las diferentes comparaciones realizadas y correlacionar significativamente con los niveles de citoquinas, actividad de la enfermedad o autoanticuerpos evaluados. La mayoría de los individuos captados fueron mujeres, con una mediana de edad de 59 años. Los pacientes SP presentaron mayores niveles en circulación de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-12p70, comparados con HD. No se encontraron diferencias significativas en el recuento de VE por volumen de plasma entre los grupos de estudio, y el diámetro promedio de las partículas aisladas fue de 190 nm. La expresión de marcadores de linaje celular mostró que la mayoría de VE proceden de eritrocitos (CD235a+), leucocitos (CD45+) y plaquetas (CD41a+) en los diferentes donantes. Los pacientes SP tuvieron mayor frecuencia de VE positivas para IgG e IgM (formando complejos inmunes) que los pacientes SN y los HD; sin embargo, las proporciones de VE con péptidos citrulinados fue muy heterogénea en los diferentes grupos de estudio. Se identificaron 358 proteínas en las VE de pacientes con AR y HD. En general se observaron múltiples proteínas disminuidas en las VE de los pacientes en comparación con HD, como componentes de la vía del complemento, algunos tipos de colágeno e inmunoglobulinas. A pesar de esto y de forma particular, se observó un enriquecimiento del inhibidor del factor H del complemento (CFHR3) en los pacientes, que se asoció positivamente con el DAS28. Las VE de pacientes SP mostraron un enriquecimiento de agrecano (FC = 2,41) y del receptor de inmunoglobulina polimérica (PIGR) (FC = 1,43) en comparación con los HD y con los pacientes SN. El agrecano correlacionó con los niveles de FR en suero (r = 0,7) y el PIGR con los niveles de la citoquina IL-6 (r = 0,61). Adicionalmente, los pacientes SP presentaron aumento significativo de las proteínas CD5L y B4GALT1 respecto a los pacientes SN. En las VE de los pacientes SN por su parte, se encontraron enriquecidas diferentes proteínas relacionadas con el transporte de colesterol. Por otro lado, la proteína C reactiva (CRP) estuvo presente en las VE de pacientes activos en comparación con los pacientes en remisión; mientras que estos últimos, presentaron elevación de la proteína MSI2. Basados en estos hallazgos se propuso una lista de 11 proteínas candidatas que discriminaron al total de los pacientes o características propias de la enfermedad, que podrían tener un papel potencial en la patología o ser evaluadas posteriormente como posibles biomarcadores de AR. El análisis del cargo proteico vesicular en pacientes con AR permitió constatar diferencias claras en el contenido y la cantidad de proteínas que discriminan a los pacientes con AR frente a personas sanas, así como diferenciar entre distintas características de la enfermedad. Para algunas de las proteínas encontradas como el agrecano, se conoce su importancia en la enfermedad como autoantígeno, y niveles séricos aumentados del CFHR3 han sido reportados en otras cohortes de pacientes con AR. Sin embargo, se encontró una gran diversidad funcional de las proteínas identificadas al alza y a la baja (matriz extracelular, metabolismo lipídico, proteínas del complemento, entre otras), que posiblemente sean un reflejo de la complejidad y los diferentes fenómenos sistémicos que acompañan esta enfermedad. Si bien se requieren de posteriores estudios que permitan confirmar las diferencias en el contenido proteico de las VE de pacientes, así como entender mejor la relación que tiene cada una de estas proteínas diferencialmente enriquecidas con la inmunopatología de la enfermedad, es muy probable que el cargo particular de las VE en AR contribuya con los procesos de pérdida de la tolerancia y daño tisular, que promueven la inflamación sistémica y crónica que caracteriza esta enfermedad.