Biosensor para la detección de IL-4 presente en enfermedades alérgicas y el síndrome hipereosinofílico (2022)
RESUMEN: La relación de la Interleuquina-4 humana (hIL-4) con la inflamación alérgica y el síndrome hipereosinofílico (HES) ha sido bien establecida. La hIL-4 bloquea la producción de IFN-γ con lo cual se presenta un aumento de los eosinófilos que son los responsables de obstrucción de los bronquios, hiperreactividad y remodelación de las vías aéreas. La IL-4 tiene 129 aa, con un peso de 14.96 KDa, es secretada por las células Th2. La cuantificación de este biomarcador es esencial para un control temprano de la inflamación de las vías aéreas en enfermedades relacionadas con el aumento de eosinófilos como las alergias y HSE. Este trabajo comprendió primero la expresión, la renaturalización a su estructura nativa y luego la purificación de la hIL-4; segundo, la confirmación por métodos bioquímicos y físicos de su estructura nativa (plegamiento); y por último abordó el desarrollo de un inmunosensor para la detección de hIL-4 que fuera útil en el diagnóstico enfermedades caracterizadas por la sobrexpresión de hIL-4 como las alergias y el síndrome hipereosinofílico. La hIL-4 fue producida de forma recombinante en Echerichia coli (E.coli) mediante transformación bacteriana por choque térmico. En la primera etapa de este proyecto la hIL4 se aisló de los cuerpos de inclusión (CI) a partir de cultivos, inducidos y expandidos. Los CI se solubilizaron para liberar la hIL-4, luego se renaturalizaron, dializaron y se purificaron por cromatografía de intercambio catiónico. Las fracciones cromatográficas se evaluaron por electroforesis de poliacrilamida y dializaron. Posteriormente la proteína se cuantificó, se liofilizó y se realizaron ensayos de verificación de plegamiento a partir de digestión con tripsina y FT-IR. Como control de interacción se realizó un ensayo de ELISA colorimétrico en donde se utilizó la hIL-4 y un anticuerpo anti-hIL-4 de ratón. Luego, en la superficie de electrodos serigrafiados comerciales de oro y tinta de carbono y por dos métodos diferentes se detectó hIL-4. Uno de los métodos consistió en activar la superficie del electrodo de trabajo de carbono con PTAA y ensamblar el anticuerpo anti-hIL-4. Posteriormente, se añadió la hIL-4 y se analizó mediante transducción electroquímica. Se demostró que la hIL-4 a pH de 7.4 se cargó positivamente favoreciendo el proceso de atracción con el mediador [Fe(CN)6] 3-/4- y se difundió más fácilmente con menor repulsión electroestática. Finalmente, se concluyó que el diseño del biosensor fue exitoso para ser un modelo a priori; fácil de manipular, bajo costo de producción, flexible y selectivo para cuantificar el aumento de hIL-4 principalmente en la inflamación alérgica y HES.