Identificación de proteínas inmunogenas de Brucella canis que inducen respuesta inmune humoral en humanos (2014)
RESUMEN: En el año 2005 en Medellín, el grupo de investigación Vericel de la Universidad de Antioquia aisló Brucella canis de animales enfermos en la región. En el transcurso de estos 9 años se han identificado caninos y humanos positivos para la infección por serología y hemocultivo; la presencia de factores de riesgo que se asocian a la presencia de la enfermedad por prácticas inadecuadas en los criaderos y se establecieron algunas características moleculares que permitieron identificar como Brucella canis grupo 2 las cepas que circulan en Medellín. Como una continuación del trabajo del grupo, durante esta tesis de doctorado se identificaron proteínas inmunógenas de Brucella canis (B. canis) útiles para el diagnóstico de la infección en humanos y otras posiblemente para caninos, utilizando análisis proteómicos de B. canis cepa Oliveri, aislada de un canino y cuyo genoma fue secuenciado. Se analizaron sueros de 3 grupos de personas: 1. positivas a Brucella canis por la prueba serológica tamiz, 2. positivas a Brucella abortus por rosa de bengala y 3. sueros de personas negativas para las dos pruebas serológicas. Por MALDI TOF-TOF, 35 fragmentos fueron analizados. Se identificaron 19 proteínas citoplasmáticas; 14 fueron identificadas definitivamente y sus epítopes y antigenicidad fueron caracterizados bioinformaticamente. Se consideraron proteínas inmunoreactivas de interés las presentes solo en los inmunoblots de las muestras positivas a B. canis. Para caninos se utilizó el mismo extracto proteico pero en 1DE-PAGE e inmunoblots. Se identificaron bandas inmuno reactivas de diferente peso molecular, dependiendo del estadio de la infección. Para identificar las proteínas presentes en las bandas inmuno reactivas y de membrana, extractos totales y de membrana de la cepa Oliveri se analizaron por LC-MS/MS. Según su antigenicidad y seleccionando proteínas que no hubieran sido reportadas previamente, se identificaron 3 proteínas citoplasmáticas inmuno reactivas para humanos y caninos: Inosina 5´ fosfato deshidrogenasa (GuaB-52 kDa), Piruvato deshidrogenasa E1 subunit beta (PdhB-49 kDa) y Factor de elongación Tu (Tuf-42.6 kDa). El regulador transcripcional de la familia TetR (27.4 kDa) fue inmuno reactiva solo para humanos; adicionalmente, se identificó la proteína de membrana Omp31. A continuación, de la cepa Oliveri se obtuvieron las secuencias de los genes y se realizó clonación, sub-clonación, expresión y purificación de las proteínas de interés. Posteriormente, se evaluó la presencia de anticuerpos IgG a través de ELISA indirecta utilizando las 5 proteínas recombinantes y una mezcla 1:1 de PdhB y Tuf como antígeno, en humanos y caninos. Para esto, sueros de 385 caninos de criaderos (200 de zona urbana, 185 de zona rural) y 91 humanos (52 de zona urbana, 39 de zona rural) en contacto con estos caninos, fueron evaluadas. Se determinó la sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN) y la concordancia de cada una de las ELISAs frente 2ME-PARP, hemocultivo y PCR.En humanos la iELISA de mejores desempeño fue la mezcla de las proteínas Pdhb y Tuf. Para caninos la iELISA no fue de utilidad pues los valores de Sensibilidad y Especificidad fueron bajos., La iELISA en conjunto con las otras pruebas diagnósticas, se constituyen en un panel para detectar esta infección en humanos, mejorando el diagnóstico y con la posibilidad de ofrecer en el corto plazo, la realización de estas pruebas en la región.