Antifungal Containing Functionalized Nanoparticles: A Therapeutic Solution for Intracellular Infections (2023)
RESUMEN: Las enfermedades infecciosas intracelulares son un problema importante de salud pública, constituyendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo y algunas de ellas pudiendo alcanzar el estatus de pandemia, como es el caso del coronavirus (COVID-19). Este tipo de infecciones se caracterizan por la alteración de algunas funciones de defensa de las células del huésped, afectando sus estrategias de combate y permitiendo que los microorganismos sobrevivan a nivel intracelular. Gracias a estas estrategias todos los virus (p. ej., Coronavirus – COVID19–, Influenza) ciertas bacterias (p. ej. Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae y Mycosplasma pnumoniae), algunos protozoos (p. ej., Toxoplasma gondii) y unos pocos hongos (como los hongos dimórficos Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis) pueden sobrevivir dentro de las células de primera línea de defensa como son los macrófagos y las células dendríticas. Estos microorganismos infecciosos, al alojarse dentro de la célula, evitan su reconocimiento y eliminación por el sistema inmune. El tratamiento actual de las enfermedades infecciosas causadas por microorganismos intracelulares representa un desafío terapéutico, debido a los patógenos resistentes a los fármacos, la incapacidad de los fármacos de lograr niveles intracelulares adecuados, la baja especificidad de los tratamientos disponibles y la interacción entre medicamentos durante las coinfecciones. El tamaño global del mercado de las terapias para enfermedades infecciosas se valoró en $ 46.8 billones de dólares en 2018 y se estima que alcance los $ 64.5 billones en 2023. Por tales razones, se hace imperativo el desarrollo de tratamientos más apropiados para hacer frente a terapias inespecíficas e ineficientes. La encapsulación de fármacos en nanopartículas funcionalizadas (NPs) es una alternativa valiosa para alcanzar el objetivo terapéutico específico con dosis más bajas. Además, las NPs mejoran la solubilidad del fármaco, evitan interacciones no deseadas y la degradación del fármaco antes de alcanzar el blanco terapéutico. El objetivo principal de este trabajo fue desarrollar una nueva estrategia terapéutica para combatir las infecciones intracelulares basada en la encapsulación de un agente terapéutico en NPs poliméricas funcionalizadas con ligandos con alta especificidad hacia los macrófagos, principal célula blanco de los microorganismos intracelulares. Se utilizó el antifúngico itraconazol (ITZ), como modelo de fármacos hidrofóbicos. Este medicamento se prescribe comúnmente a pacientes con infecciones fúngicas serias como la histoplasmosis, una micosis que ha sido reportada en todos los continentes, con una alta incidencia en América. Se trata de una afección sistémica que puede afectar tanto individuos inmunosuprimidos como inmunocompetentes, aunque las manifestaciones clínicas son mucho más severas en los primeros, como los infectados con el VIH. El tratamiento con ITZ representa un reto debido a sus múltiples limitaciones como la dificultad para alcanzar concentraciones adecuadas a nivel intracelular y las interacciones medicamentosas, lo que hace que se requieran dosis repetidas durante largos períodos y se ocasionen efectos adversos como hepatotoxicidad. En este trabajo se encapsuló con éxito ITZ en NPs basadas en dos tipos de PLGA, alcanzando nanotransportadores estables y moderadamente polidispersos con tamaño adecuado (200 nm) y capacidad de carga (CC) (6,6 %) y eficiencia de encapsulación (EE) (80 %) óptimos al reducir el pH y al modular el tipo y la concentración de una mezcla de tensoactivos. Las NPs se autoensamblaron por el método de nanoemulsión de alta energía y se caracterizaron por espectroscopía infrarroja transformada de Fourier (FT-IR) y calorimetría diferencial de barrido (DSC), para estudiar las interacciones entre ITZ-PLGA. La formulación mostró liberación inmediata inicial de ITZ, seguida de una fase de liberación prolongada que se ajustaba a un modelo cinético de difusión Fickiana y una alta estabilidad a 4 °C y 37 °C. El ITZ encapsulado eliminó eficientemente a H. capsulatum, con una IC50 similar con respecto al ITZ libre. Adicionalmente los nanosistemas se funcionalizaron con el anticuerpo F4/80 por adsorción física y acoplamiento covalente. El acoplamiento covalente fue más eficiente que el método de adsorción, pero el enmascaramiento de la corona proteica fue similar en ambos métodos. Los ensayos in vitro mostraron que las NPs funcionalizadas con F4/80 aumentaron la captación de NPs por los macrófagos J774, de forma específica en comparación con células musculares y de ovario, las cuales no presentaron captación de las NPs. Por otro lado, se demostró un mejor efecto antifúngico de las NPs funcionalizadas con J774 al reducir la cantidad de ITZ para controlar H. capsulatum en co-cultivo con macrófagosperitoneales y sin ningún efecto citotóxico sobre los macrófagos después de 24 h. La encapsulación del ITZ moduló la expresión génica de citoquinas anti-inflamatorias y proinflamatorias (IL-1β, IFN-γ, IL-6 e IL-10) en macrófagos. Además, el recubrimiento de anticuerpos anti-F4/80 mejoró la respuesta antifúngica natural y adecuada en las células, ejerciendo un efecto sinérgico que impidió el crecimiento del hongo a nivel intracelular. Posteriormente, se evaluó el efecto del ITZ encapsulado en las NPs de PLGA sin funcionalizar en un modelo in vivo de histoplasmosis. Los resultados mostraron que la encapsulación de ITZ en NPs de PLGA administradas por vía intraperitoneal mejoró el efecto antifúngico con respeto al tratamiento convencional (Sporanox), reduciendo significativamente la UFC tras las primeras dosis, evitando la desimanación de la infección. La biodistribución en el grupo de ratones tratados con ITZ encapsulado mostró una mayor concentración de ITZ en el hígado, el bazo y los pulmones en comparación con el tratamiento convencional. Adicionalmente, el tratamiento presentó un efecto inmunomodulador sobre la producción de citoquinas proinflamatorias y antiinflimatorias, lo cual se confirmó por histopatología. En general, los resultados sugieren un efecto sinérgico del fármaco encapsulado y el efecto inmunomodulador contribuyendo al control de infecciones, evitando su diseminación. Finalmente, para mejorar la biodistribución de los nanosistemas se encapsuló el itraconazol en NPs PEGiladas y/o funcionalizadas con alta especificidad por los macrófagos y se evaluó la absorción de proteínas en su superficie y la formación de la denominada corona de proteína (CP). La formación de la CP en las NPs impactó en su absorción celular y efecto antifúngico. La evaluación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y de las unidades formadoras de colonias (UFC) demostraron que el ITZ encapsulado en NPs PEGiladas mejoró el efecto antifúngico en comparación con las NP sin PEGilación. La mejora antifúngica puede estar relacionada con el "efecto de furtividad del PEG debido a la reducción de la adsorción de proteínas inespecíficas, lo que permite una mayor liberación del fármaco. Las NP funcionalizadas con anticuerpos anti-F4/80 y anti-MARCO, o manosa sin PEG y tratadas con CP se captaron en mayor proporción, pero, en presencia de PEG, redujeron significativamente la endocitosis, dominando el efecto sigiloso de PEG.