Evaluación del efecto inhibitorio de N-glucosil aminoácidos sobre la adherencia ex vivo de P. multocida A al epitelio respiratorio de septo nasal de conejo (2021)
En este estudio se logró sisntetizar 6 N-glucopeptidos, los cuales llevan glucosa como carbohidrato principal acoplado a 6 aminoaciodos diferentes, mediante síntesis de Péptidos en Fase Sólida (SPPS-Fmoc/tBu) y usando el método de construcción por bloques aminoácido-monosacárido. Posteriormente se aisló P. multocida A cepa AUN001, obtenida de muestras de cornetes, tráquea y pulmones de conejos con signos de rinitis y neumonía procedentes de granjas de la Sabana de Bogotá (Colombia). El microorganismo se cultivó en agar infusión cerebro corazón, se seleccionaron las colonias de morfología redonda, de color gris, no hemolíticas. Bajo tinción de Gram se identificaron como cocobacilos, Gram negativos, bipolares y mediante pruebas bioquímicas eran catalasa y oxidasa positivas, no crecen en agar MacConkey, no hemolíticas, indol positivas, ureasa negativas, ornitina descarboxilasa positivas, glucosa positivas, lactosa negativas, sacarosa positivas, maltosa negativas, lo cual concuerda con previos reportes (Dziva, Muhairwa, Bisgaard, & Christensen, 2008). La identificación molecular se llevó a cabo mediante la amplificación del locus genético hyaD con los primers: F. 5' TGC CAA AAT CGC AGT CAG 3' and R. 5' TTG CCA TCA TTG TCA GTG 3' descritos previamente. Cada uno de los glicoconjugados se ensayó de manera individual en septos nasales de feto de conejo para comprobar su inocuidad, se utilizó el modelo ex vivo de cultivo de explantes de septo nasal de feto de conejo en donde los septos nasales estuvieron expuestos a cada glicoconjugado en una concentración de 250µg/200µL durante 2 horas; una vez concluido el experimento los septos fueron fijados en formol bufferado al 10%, teñidos con hematoxilina y eosina y evaluados para microscopia óptica de luz convencional, concluyendo que ninguno de los glicoconjugados inducia cambios microscópicos en los tejidos y que por lo tanto se consideraban inocuos y podían ser empleados en los siguientes experimentos. Posteriormente, se realizó incubación de la bacteria (1X108 UFC/ml ) con cada uno de los glicoconjugados sintetizados (250µg/200µL) durante 30 minutos a 37ºC, en atmosfera controlada con 5% de CO2; una vez concluido este tiempo, se expusieron los septos nasales de feto de conejo a la mezclas anteriormente descritas durante dos horas; terminado este tiempo los septos nasales fueron fijados en formol bufferado al 10%, teñidos con hematoxilina y eosina y evaluados para microscopia óptica de luz convencional, adicionalmente se realizó la técnica de inumoperoxidasa indirecta (IPI) con el fin de marcar P. multocida AUN001 y determinar su ubicación sobre los septos nasales experimentales. El procesamiento de la información se realizó a través del lenguaje de programación R (2021) haciendo uso de la interfaz RStudio (2021). Debido a que las variables de interés no superaron los supuestos de normalidad y homogeneidad de las varianzas, se realizó para la comparación entre efectos, la prueba de Kruskal Wallis y para comparar las medianas entre sí, se usó la prueba de Wilcoxon, ambas pruebas son no paramétricas y permiten verificar efectos medianos de los tratamientos o condiciones sobre la variable respuesta. Los resultados de este estudio demostraron que los glicoconjugados sintetizados se comportaron de manera similar entre si, pero si mostraron diferencias con respecto a los controles al inhibir de forma significativa pero parcial la adherencia de P. multocida A UN001 al epitelio respiratorio de los conejos y con ello igualmente se disminuyó parcialmente la intensidad de los cambios microscópicas evaluados.