Análisis estructural y funcional de la Nicotinamida/Nicotinato Adenililtransferasa (NMNAT) de Plasmodium falciparum : enzima central del metabolismo del NAD. (2018)
Los dinucleótidos de piridina y adenina (NAD+ y NADP+) son moléculas esenciales en todos los organismos, ya que participan en diversos procesos biológicos, tales como rutas de producción energética, transducción de señales, síntesis de movilizadores de calcio y mantenimiento de sistemas REDOX. Su relevancia no solo es atribuida a su función como cofactores de numerosas oxidorreductasas, también estos dinucleótidos son co-sustratos en diversas modificaciones covalentes de proteínas determinantes en la regulación de procesos celulares como replicación, conservación telomérica, apoptosis, transcripción, ciclo celular, restricción calórica y supervivencia celular. El descubrimiento de los anteriores mecanismos de regulación dependientes de este dinucleótido ha señalado la importancia de la biosíntesis del NAD+ como punto central en el control de estos procesos. Las dos vías de biosíntesis del NAD+, la vía de novo y la vía de salvamento, convergen en una reacción catalizada por la enzima Nicotinamida/Nicotinato Mononucleótido Adenililtransferasa (NMNAT) (EC2.7.7.1) perteneciente a la familia de fosfodiesterasas nucleotidiltransferasas, paso clave en la biosíntesis del NAD+. El estudio de la NMNAT en diferentes organismos, ha demostrado la importancia de la biosíntesis del NAD+ en el desarrollo de diversas patologías y ha permitido identificar diferencias significativas entre las enzimas de organismos procariotas y eucariotas, postulándola como posible blanco de agentes terapéuticos. Una de las enfermedades parasitarias de mayor incidencia a nivel mundial es la malaria, producida por un protozoario del género Plasmodium, el cual se estima es causante en promedio de dos millones de muertes anualmente. Se han implementado diferentes estrategias de control enfocadas en la erradicación del vector y en la eliminación del parasito mediante el desarrollo de insecticidas y el diseño de vacunas contra antígenos de superficie, respectivamente. Sin embargo, se ha observado incremento de la enfermedad debido a la resistencia desarrollada por los vectores y algunas especies del parásito. El metabolismo del NAD+ cumple una función importante en la supervivencia de todos los organismos estudiados a la fecha. Con el fin de desarrollar nuevas estrategias de control e identificar nuevos blancos terapéuticos, es necesario establecer investigaciones enfocadas en construir un conocimiento integral de la biología del parásito, el metabolismo del NAD+, así como las enzimas involucradas en su biosíntesis, ofrecen un excelente punto de partida, dada su esencialidad en procesos básicos celulares. Estudios realizados en nuestro laboratorio, permitieron identificar, clonar y expresar la NMNAT de P. falciparum (PfNMNAT) en el sistema heterólogo E. coli. La purificación y caracterización enzimática de dicha proteína, permitió establecer aproximaciones experimentales claves para comprender el metabolismo del NAD+ en este parásito. Estudios bioinformáticos, realizados en este estudio, definieron la existencia de secuencias exclusivas de la proteína PfNMNAT, evidenciando componentes estructurales únicos en la enzima del parásito, en comparación con las NMNATs humanas. Igualmente se produjeron anticuerpos contra la PfNMNAT, constituyendo herramientas importantes para la caracterización de la enzima. El proyecto planteado pretende dar continuidad al estudio del metabolismo del NAD+ en Plasmodium, al caracterizar la PfNMNAT punto clave de la ruta biosintética, desarrollando aproximaciones in-vivo e in-vitro. El primer acercamiento está encaminado a determinar localización y niveles de expresión a través del ciclo eritrocítico del parasito, definiendo en espacio y tiempo su relevancia y asociación con determinados procesos del ciclo. El segundo acercamiento in-vitro, abordará el estudio estructural de la proteína, empleando la proteína recombinante correspondiente, con el fin de determinar su estructura mediante estudios de difracción de rayos X.