Determinación de los cambios inducidos por un elicitor biótico en el perfil metabólico y actividad enzimática de cultivos in vitro de Piper cumanense - Santamaría Torres, Mary Andrea (2020)
Las plantas están constantemente expuestas a diferentes factores bióticos y abióticos, por lo cual deben adaptar su perfil metabólico para defenderse mediante la biosíntesis de metabolitos secundarios. Estos metabolitos aislados o en extracto tienen propiedades aprovechables en el campo farmacéutico, cosmético, agroquímico, alimentario, entre otros. Sin embargo, obtener grandes cantidades de un compuesto natural para estudios que abarquen desde la elucidación estructural, ensayos de diferentes actividades biológicas y hasta su comercialización representa un gran desafío, puesto que, una de las principales limitantes en el estudio de estos metabolitos es la baja cantidad con que se producen en la planta, trayendo como consecuencia un bajo rendimiento en los compuestos purificados, por ello la mayoría de los aportes científicos, si bien representan un avance indiscutible, suele ser información que sólo queda como aporte al conocimiento. Una herramienta biotecnológica utilizada para superar estas limitaciones es el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales que, bajo condiciones de elicitación inducen la producción de metabolitos de defensa en las plantas y en consecuencia las enzimas asociadas a su biosíntesis. Piper cumanense es una especie cuyo extracto, aceite esencial y metabolitos aislados han mostrado una prometedora actividad antifúngica, sin embargo, su bajo rendimiento ha impedido realizar investigaciones más profundas a nivel experimental y comercial, lo que ha incentivado la necesidad de buscar una alternativa que permita no sólo la producción de la especie in vitro sino la producción in vitro de sus metabolitos de una forma controlada, permanente y sostenible. Teniendo en cuenta lo anterior, en esta investigación se determinaron los cambios metabólicos en cultivos in vitro de Piper cumanense bajo condiciones de elicitación biótica, y mediante un enfoque enzimático se estimó si estos cambios estuvieron relacionados con las actividades de las enzimas fenilalanina amonio liasa y peroxidasa. Para este propósito, las plántulas in vitro de 5 meses de edad y las suspensiones celulares fueron fortificadas con extracto de micelio acuoso autoclavado de Fusarium solani durante 5 y 15 días para las plántulas in vitro y por 24 y 72 horas para las células en suspensión. Los metabolitos secundarios fueron analizados por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y la evaluación de la actividad enzimática de PAL y peroxidasa se realizó espectrofotométricamente. Se encontró que el perfil cromatográfico de los extractos obtenidos de suspensiones celulares y de plántulas in vitro variaban significativamente entre sí. Metabolitos secundarios como fenilpropanoides y terpenos fueron detectados en plántulas in vitro, por el contrario, las suspensiones celulares estaban mayormente compuestas por ácidos grasos. Además, la elicitación en plántulas in vitro durante 5 y 15 días aumentó la producción de apiol y fitol respectivamente, y en ambos casos hubo una sobreexpresión del compuesto No identificado 14 considerado producto directo del proceso de elicitación. Por el contrario, la elicitación de suspensiones celulares durante 24 h no mostró ningún efecto sobre el perfil metabólico, sin embargo, con una exposición de 72 h los fitoesteroles aumentaron significativamente. A nivel enzimático se encontró en plántulas in vitro una inducción significativa de actividad PAL a los 5 días y de peroxidasa a los 15 días de tratamiento, correlacionados con el contenido de miristicina y fitol, respectivamente. En contraste, la elicitación no tuvo efecto sobre ninguna de las dos enzimas en las suspensiones celulares, lo que podría explicar, al menos en parte, la baja producción detectada de metabolitos secundarios. El enfoque utilizado en esta investigación permitió detectar cambios en el perfil metabólico y enzimático de las plántulas in vitro y dejó una evidencia clara que bajo las condiciones de análisis se necesita de cierto grado de diferenciación y madurez celular para que se dé la biosíntesis de metabolitos secundarios.