Estudio de factores proteicos asociados a la regulación de los genes HSP70 en Leishmania braziliensis - Nocua Martínez, Paola Andrea (2017)
La leishmaniasis constituye un grupo de enfermedades producidas por parásitos protozoos pertenecientes al género Leishmania. Durante su ciclo de vida, el parásito alterna entre un vector invertebrado y un hospedero vertebrado, lo que le exige desarrollar cambios morfológicos y bioquímicos que le permitan sobrevivir y adaptarse al estrés celular que debe enfrentar en ambos hospederos. Adaptación que depende de la regulación de la expresión de una amplia variedad de genes, dentro de los cuales se encuentran los genes HSP70. Se ha demostrado que estos parásitos, tanto del subgénero Leishmania como del subgénero Viannia, poseen dos tipos de genes HSP70 (HSP70-I y II), los cuales se diferencian en su región 3´ no traducida (3´ UTR); diferencias relacionadas con los mecanismos moleculares de adaptación del parásito para tolerar el estrés térmico al que es sometido durante su ciclo de vida. Ensayos recientes, en L. braziliensis, han identificado proteínas con afinidad a las regiones UTR de los ARNm de estos genes, hallazgo de gran importancia teniendo en cuenta que la regulación de su expresión génica ocurre principalmente a nivel postranscripcional, y está mediada por la interacción entre elementos reguladores cis y trans del parásito. Entre las proteínas identificadas en dicho estudio se encuentran las proteínas LbrM.25.2210 (SCD6) y LbrM.30.3080 (RBP42), para las cuales, en esta Tesis, se estudiaron sus características moleculares y funcionales como factores proteicos implicados en la regulación génica en Leishmania. Inicialmente, se confirmó la capacidad de estas proteínas para interactuar de forma directa con moléculas de ARN. Observándose que estas proteínas son capaces de interactuar con un motivo con características de elemento ARE. Por otra parte, la interacción de estas proteínas con moléculas de ARN también fue demostrada in vivo, encontrándose asociados varios transcritos codificantes para proteínas relacionadas con el metabolismo y degradación celular. De forma particularmente destacable, asociada a la proteína RBP42 se identificó el transcrito correspondiente al gen HSP70-II. Así mismo, se encontraron asociaciones de las proteínas de estudio con transcritos codificantes para proteínas involucradas en la diferenciación y sobrevivencia del parásito en condiciones de choque térmico. Con el propósito de dilucidar los posibles procesos biológicos en los cuales podrían estar involucradas estas proteínas se determinó el interactoma de cada una de ellas. Cabe destacar que los interactomas comparten una alta proporción de proteínas, lo que sugiere algún tipo de relación funcional; de hecho, las dos proteínas forman parte de los interactomas recíprocos. Ambos interactomas están enriquecidos en proteínas asociadas a los procesos de traducción, metabolismo de ARN y regulación de la expresión génica. Como apoyo a un posible papel de estas proteínas en la regulación postranscripcional, cabe indicar que se encontraron varias proteínas cuyos homólogos han sido reportados como constituyentes de gránulos de ARN, principalmente cuerpos de procesamiento y gránulos de estrés. Finalmente, para analizar la función de SCD6 y RBP42 se generaron líneas mutantes de parásitos que sobreexpresan las proteínas fusión SCD6-mCherry y RBP42-mCherry. La línea sobreexpresante control (expresión de la proteína mCherry) de L. braziliensis pudo ser establecida, pero, por el contrario, las líneas de sobreexpresión para cada una de estas proteínas, luego de una semana de crecimiento, perdieron viabilidad. Estos resultados, si bien no concluyentes, sugieren que la sobreexpresión de SCD6 y RBP42 en L. braziliensis afecta negativamente al desarrollo y sobrevivencia del parásito. Como alternativa, se logró, generar estas líneas de sobreexpresión utilizando la especie L. major, lo que permitió determinar importantes implicaciones de estas proteínas en el desarrollo de los parásitos; observándose alteraciones morfológicas significativas y el retardo del crecimiento de los parásitos en condiciones fisiológicas de crecimiento, siendo el efecto mucho más pronunciado en condiciones de estrés térmico. Por otra parte, la capacidad infectiva in vitro de estos parásitos mutantes resulta significativamente afectada en relación con la cepa silvestre. En conjunto, este estudio aporta la caracterización de las proteínas SCD6 y RBP42 como proteínas de unión a ARN que, junto al resto de análisis complementarios sugieren su relevante implicación en la regulación de la estabilidad o degradación de un amplio grupo de transcritos en Leishmania.