Generación de un modelo de esfera multicelular organotípica para el estudio del microambiente de células madre hematopoyéticas humanas - Mejía Cruz, Claudia Camila (2018)
Introducción: Se ha descrito que las características biológicas de las células madre hematopoyéticas (CMH) humanas están condicionadas por el microambiente de la médula ósea (MO). Estas células conforman nichos en la MO al interactuar con otras poblaciones celulares como las células madre mesenquimales (CMM) y las células endoteliales (CE). Se han diseñado múltiples estrategias en cultivos en dos dimensiones (2D) y cultivos en tres dimensiones (3D) con el objetivo de comprender las interacciones de las CMH en su nicho; sin embargo, estos cultivos aún distan considerablemente de las condiciones fisiológicas in vivo de la MO humana. Con el objetivo de determinar el efecto sinérgico de las células presentes en MO sobre la viabilidad, proliferación, diferenciación y capacidad multipotente de las CMH, se desarrolló un modelo de esferas multicelulares organotípicas que imitan el microambiente medular in vivo a través de un sistema de cultivo 3D por levitación magnética. Materiales y métodos: Para la generación de las esferas multicelulares organotípicas por levitación magnética se utilizaron CMH aisladas a partir de sangre de sangre de cordón umbilical (SCU), CMM aisladas a partir de MO y CE de microvasculatura dérmica (CC-2811, Lonza®). Se inició con la estandarización del cultivo 3D, posteriormente se realizaron análisis morfológicos de las esferas multicelulares, en donde se determinó la esfericidad, volumen, porcentaje de agregación y viabilidad. Asimismo, se realizaron evaluaciones histológicas, inmunohistoquímicas, tinciones inmunofluorescentes y la determinación del porcentaje de área de expresión de Ki-67, CD133, CD33 y CD7 y su co-expresión con CD34 dentro de las esferas multicelulares. Finalmente, se evaluó la capacidad multipotente de las CMH tras el contacto con CMM y CE en la esfera multicelular. Resultados: La relación óptima de cultivo celular con las tres poblaciones celulares para la generación de esferas multicelulares organotípicas estables fue de 1 CMM: 2 CMH: 2 CE. Se obtuvieron estructuras viables al día 10 y 15 de cultivo con un índice de esfericidad mayor al 0.8 (0.83-0.91), un porcentaje de agregación mayor al 70% (64%-97%) al 5 día de cultivo y una disminución del volumen directamente proporcional al tiempo de incubación. Los estudios histológicos de hematoxilina y eosina, y la evaluación de vimentina de las esferas multicelulares demostró una estructura interna organizada, sin núcleos picnóticos ni centro necrótico. Se aprecia una expresión global de CD34 preservada en el tiempo, una mayor co-expresión de Ki-67 con CD34 en la esfera experimental respecto a los controles, una preservación de las áreas de expresión del antígeno CD133 tras 10 y 15 días de conformación de la esfera y un escaso porcentaje de área de expresión de antígeno asociados con diferenciación mieloide (CD33) y 18 diferenciación linfoide (CD7 citoplasmático). La capacidad funcional de las CMH después de permanecer en cultivo con CMM y CE se preserva en los esferoides experimentales por 10 y 15 días, generando unidades formadoras de colonias primitivas. Conclusiones: Se generó un modelo de estudio de nicho estromal el cual favorece el mantenimiento de las CMH en estadio primitivo, preservando su viabilidad y sus características multipotentes tras 15 días de cultivo. Este modelo de esfera multicelular organotípica permite por primera vez evaluar de manera sinérgica el efecto de dos poblaciones celulares estromales como son las CMM y las CE sobre características biológicas de las CMH.