Evaluación de la transformación de pentolita solida por bacterias degradadoras de TNT y PETN - Pinilla, Gustavo (2020)
La pentolita es un explosivo sólido ampliamente utilizado en la industria civil y militar como componente de cargas de detonación, está formado por una mezcla 1:1 de TNT :PETN que puede llegar a contaminar ambientes como suelos y aguas debido a residuos del proceso de fabricación y de su posterior uso (p.ej., cargas sin detonar). La exposición prolongada a la pentolita puede provocar alteraciones a la salud humana ya que el TNT puede producir cáncer y daño hepático, mientras que el PETN puede producir afectaciones a las vías respiratorias y problemas cardiacos. En estudios de laboratorio se ha demostrado que la presencia de TNT inhibe la biodegradación de PETN en cultivos de enriquecimiento. En muchos ensayos de transformación de explosivos se utilizan los compuestos disueltos en medio líquido a bajas concentraciones (~ 100 mg/L) y no hay estudios en la literatura con la pentolita sólida. Por tanto, en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana, como parte del estudio diseo de un sistema con microorganismos degradadores de PETN y TNT incorporado en el explosivo pentolita desarrollado en conjunto con la Universidad de la Salle e INDUMIL, se buscó obtener bacterias capaces de transformar TNT y PETN, a partir de muestras de suelo contaminado con explosivos provenientes de la planta INDUMIL, la cual sintetiza PETN y realiza la mezcla de TNT y PETN. La obtención de bacterias transformadores de explosivos se realizó en condiciones aerobias con cultivos de enriquecimiento y biocebos, y en condiciones anaerobias con cultivos de enriquecimiento. En estos se ensayos se utilizó un medio mínimo mineral (MT2) con explosivo (TNT ó PETN) como única fuente de nitrógeno (50 mg/L). Se encontraron bacterias (cepas puras) y cultivos mixtos de bacterias a las que se les evaluó la habilidad de transformar TNT y PETN (100 mg/L) disuelto en medio MT2 líquido y se seleccionaron aquellas que fueron capaces de transformar el explosivo (>50%). En esta fase del proyecto se obtuvieron en total 9 bacterias y 11 cultivos mixtos (31 bacterias) capaces de transformar TNT, 1 bacteria y 12 cultivos mixtos (30 bacterias) capaces de transformar PETN y 3 bacterias capaces de transformar pentolita en condiciones anaeróbicas, para un total de 74 bacterias las cuales fueron identificadas mediante secuenciación del 16S rARN. Con el fin de encontrar la mejor combinación posible de bacterias y cultivos mixtos, se establecieron 19 consorcios definidos, con base en los resultados de la caracterización de la transformación por parte de las bacterias seleccionadas. Se realizo un estudio de transformación de pentolita sólida por parte de estas bacterias, cultivos mixtos, consorcios definidos y microcosmos sin inoculo utilizando microcosmos con MT2 enriquecido con una fuente de carbono y nitrógeno (MT2M). A los microcosmos se le agregaron dos granallas de pentolita (explosivo sólido), los microcosmos se incubaron a temperatura ambiente (~ 21° C) en oscuridad sin agitación. La transformación de pentolita se evaluó en el tiempo (~ 2500 días) realizando 6 muestreos por sacrificio (n=3) midiendo la concentración de TNT y PETN por HPLC, y un recuento microbiano mediante microgota en agar nutritivo. Las bacterias aisladas de los recuentos en el último evento de muestreo se conservaron a - 80°C en MT2 con glicerol y skim milk. Las bacterias, cultivos mixtos y consorcios 12 definidos capaces de transformar pentolita sólida se seleccionaron con base en la transformación obtenida al final del estudio y la transformación acumulativa de los explosivos en el tiempo. En el estudio se observó una transformación más alta del PETN (21%) que del TNT (18%). Durante el estudio se obtuvieron 3 cultivos mixtos (CMP231, CMP227 y CMT228), una bacteria (T21) y dos consorcios definidos (C1 y C4) capaces de transformar pentolita sólida. Se observo una mayor transformación de los explosivos (19 % TNT, 23 % PETN) en las bacterias y cultivos mixtos que en los consorcios definidos (17% TNT, 20% PETN), lo cual indica que son mejores a la hora de transformar explosivo sólido. Se observaron altos recuentos (5 log UFC/mL) de bacterias en los microcosmos, lo que indica que son capaces de crecer en presencia de pentolita sólida. Los resultados de la secuenciación del gen 16S rARN de las bacterias encontradas al final del estudio en estos microcosmos encontraron que pertenecían a los géneros Stenotrophomonas sp., Citrobacter sp., Pseudomonas sp. y Serratia sp. que en su mayoría no coincidían con las bacterias inoculadas, lo que podría indicar que las bacterias recuperadas en el último evento de muestreo corresponden a las que se encuentran en las granallas. La transformación de explosivos sólidos por parte de los cultivos mixtos seleccionados y las bacterias encontradas al final del estudio debe ser estudiado en más detalle, sin embargo, bajo las condiciones de este ensayo logramos determinar la transformación de pentolita sólida.