Clonación y expresión de la 3-fitasa A de Aspergillus niger en Pichia pastoris (2018)
Las fitasas (E.C. 3.1.3.8), son enzimas fosfocatalíticas que realizan la hidrólisis parcial o total de los ortofosfatos presentes en el ácido fítico. El fósforo y el inositol se almacenan principalmente como ácido fítico en los cereales y legumbres que se usan comercialmente como pienso para animales monogástricos y en las semillas oleaginosas, constituyendo entre el 60-90% del contenido total de fósforo en las plantas. Las fitasas hidrolizan el ácido fítico a una molécula de inositol y seis moléculas de fosfato inorgánico. Sin embargo, estos fitatos no pueden hidrolizarse en el intestino de animales monogástricos, y los fosfatos asociados permanecen sin absorberse, siendo necesaria la adición de fosfatos en la dieta para así evitar deficiencias de fósforo, y disminuir su presencia en la excreta de estos animales. El objetivo fue expresar la 3-Fitasa A recombinante obtenida a partir de la secuencia codificante optimizada de Aspergillus niger en Pichia pastoris. El gen sintético PhyA se clonó bajo el control del promotor constitutivo de la gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP) de P. pastoris. Se seleccionaron dos clones recombinantes para evaluar los parámetros de crecimiento y producción de la enzima a escala de 100 mL en un tiempo total de incubación de 156 horas. La máxima actividad fitasa para cada clon se obtuvo a las 10 horas con 15.86 mUmL-1 y una actividad específica de 0.48 mUmg-1 para el clon 1, y 26.87 mUmL-1 con una actividad específica de 0.81 mUmg-1 para el clon 2, los parámetros obtenidos para cinética de reacción cero (velocidad volumétrica) para el clon 1, K0= 0.160 h-1 y td= 4.53 h y para el clon 2, fueron K0= 0.209 h-1 , td= 3.502 h, creciendo más rápido y en menos tiempo el clon 2. Los resultados obtenidos sugieren que el diseño realizado previamente para clonar y expresar la PhyA de A. niger en P. pastoris bajo un promotor constitutivo es factible, y se propone escalar el proceso de producción, así como el mejoramiento del medio de cultivo para obtener una mayor actividad fitasa, con el fin de generar una alternativa económica de producción de fitasas para uso en la industria pecuaria.