Construcción de mutantes de Candida glabrata resistentes a Caspofungina para el factor de transcripción CRZ1 de la vía Calmodulina/Calcineurina mediante el sistema CRISPR-Cas9 (2018)
INTRODUCCIÓN: Candida glabrata es una levadura oportunista que causa infecciones fúngicas invasivas en pacientes inmunosuprimidos con una tasa de mortalidad muy alta debido a la resistencia que este microorganismo ha desarrollado a los antifúngicos; esta levadura posee MIC muy alta para fluconazol, y en los últimos años se han aislados cepas resistentes a la caspofungina (equinocandina de elección como tratamiento de primera línea) debido a mutaciones en genes FKS cuya sobreexpresión es mediada por la vía Calcineurina/Calmodulina. Por lo anterior se hace necesario realizar una mutante del factor de transcripción CRZ1 y evidenciar retornar de un fenotipo resistente a sensible. OBJETIVO: Obtener mutantes de Candida glabrata resistentes a Caspofungina aisladas de muestras clínicas para el factor de transcripción CRZ1 mediante el sistema CRISPR-Cas9. METODOLOGÍA: se realizó una búsqueda informática de la literatura sobre el sistema CRISPR-Cas en levaduras. Además, se diseñó un plásmido con la secuencia del sgRNA complementario a una fracción de la secuencia del gen CRZ1, y con el sistema CRISPR-Cas9 para transfectar las levaduras y seleccionar las cepas mutadas a través de un marcador de selección fluorescente. RESULTADOS: En la búsqueda sistemática se analizaron 39 artículos en los cuales, se obtuvo información sobre el sistema CRISPR-Cas en levaduras de importancia clínica e industrial, se documentó las variantes descritas en levaduras para el uso del sistema CRISPR/Cas. La construcción bioinformática de C. glabrata, se obtuvieron dos sgRNA con score de 89 y 71%, un mapa del constructo del plásmido con el sistema CRISPR más el marcador YFP y el SgRNA, la generación del mutante no se logró realizar por incumplimiento de la casa comercial. CONCLUSIÓN: El sistema CRISPR es un sistema muy versátil y eficientes, que permite realizar la edición del genoma de diferentes organismos celulares. Para lograr el éxito de la edición, es muy importante un buen diseño bioinformática que garantice la especificidad del sistema, y el reconocimiento adecuado de la Cas9 de la secuencia diana que se quiere editar.