Identificación de un gen de patogenicidad en la bacteria ambiental y patrógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa. (2003)
Pseudomonas aeruginosa es reconocida como una bacteria importante en biodegradación de hidrocarburos. También ha sido reportada como bacteria promotora del crecimiento en plantas. Estas dos lineas de evidencia muestran el gran potencial de utilización que tiene esta especie. Pero el hecho de que esta bacteria este fuertemente asociada con infecciones hospitalarias o infecciones a pacientes inmunocomprometidos ha restringido su uso en procesos de tratamiento ambiental. Varios grupos a nivel internacional han intentado encontrar diferencias entre los aislamientos ambientales y los aislamientos clínicos, ya que tradicionalmente se ha asumido que los aislamientos ambientales son inocuos y los clínicos son patógenos. Hasta el momento no existen evidencias que soporten esta suposición. En un trabajo preliminar realizado por un investigador de este proyecto en el que se evaluó el genoma completo de aislamientos colombianos clínicos y ambientales de P. aeruginosa usando microarreglos, se detectó un posible gen candidato presente en los aislamientos clínicos y ausente en los aislamientos ambientales. El gen candidato es un gen descrito como proteina hipotética en la base de datos del genoma de P. aeruginosa y que presenta homología con el gen hvn de Vibrio fischeri; en V. fischeri los genes hvn codifican para la enzima NAD+ - glicohidrolasa, y se ha propuesto que esta enzima puede tener un papel relacionado con la colonización de los tejidos animales y con patogenicidad. La presencia de este gen en aislamientos clínicos de P. aeruginosa y su ausencia en aislamientos ambientales podría servir de indicador de su fuente de aislamiento y tal vez de su potencial patogenicidad. Este resultado requiere de confirmación por metodologías adicionales (PCR, ensayos enzimáticos y pruebas de patogenicidad) y de pruebas con un número mayor de aislamientos que permitan corroborar la asociación de la presencia del gen con la fuente de aislamiento de la bacteria. Por lo tanto, esta propuesta tiene como objetivo general determinar si existe correlación entre la presencia y actividad del gen homólogo a hvn con la fuente de aislamiento y el potencial patógenico de aislamientos clínicos y ambientales de P. aeruginosa. Como objetivos específicos se plantean: 1. Confirmar usando PCR la presencia del gen homólogo a hvn en las cepas clínicas y su ausencia en las cepas ambientales de P. aeruginosa probadas anteriormente con microarreglos 2. Confirmar la asociación entre presencia/ausencia y la fuente de aislamiento con nuevos aislamientos clínicos y ambientales de P. aeruginosa. 3. Relacionar patogenicidad de las cepas de P. aeruginosa con la fuente de aislamiento, mediante pruebas de patogenicidad en Drosophila melanogaster. 4. Relacionar patogenicidad de las cepas de P. aeruginosa con la producción de la enzima NAD+ - glicohidrolasa. 5. Producir la enzima codificada en P. aeruginosa por el gen homólogo a hvn por clonaje en un vector de expresión en E. coli y determinar su actividad. Para lograr los objetivos propuestos se plantea estandarizar la tecnica de PCR para la amplificación del gen homólogo a hvn, usando las 10 cepas probadas anteriormente con microarreglos. Se obtendrán 15 nuevos aislamientos clínicos y 15 ambientales en los que se evaluará la presencia/ausencia del gen de interés con el protocolo de PCR estandarizado. Se espera que el gen homólogo a hvn se encuentre presente en las cepas clínicas y ausente en las ambientales. Posteriormente se realizarán pruebas de patogenicidad de los aislamientos clínicos y ambientales en individuos hembra de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, y se evaluará la producción y actividad de la enzima NAD+ - glicohidrolasa por los aislamientos. De esta forma se espera correlacionar la fuente de los aislamientos, con su patogenicidad en el modelo escogido y con la producción de la enzima NAD+ - glicohidrolasa.